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摘要：在過(guò)去十年中，斑馬魚開始作為發(fā)育生物學(xué)的典范，也得到了免疫學(xué)家和腫瘤學(xué)家的關(guān)注。斑馬魚具有體積小、繁殖力強(qiáng)、基因組完整等特點(diǎn)，是一個(gè)極具吸引力的模型體系。事實(shí)上，魚在生命早期是透明的，結(jié)合越來(lái)越多的魚免疫細(xì)胞報(bào)告，可以在體內(nèi)追蹤完整機(jī)體的免疫反應(yīng)。由于斑馬魚從受精卵開始發(fā)育，可以從生命的開始監(jiān)控免疫發(fā)育。斑馬魚是研究腸道炎癥和損傷基本過(guò)程的一種有趣的模式生物。本文將首先提供斑馬魚腸道發(fā)育、細(xì)菌定植和免疫的一些背景知識(shí)，顯示出與哺乳動(dòng)物的相似性和差異性。

關(guān)鍵詞：斑馬魚 小腸結(jié)腸炎 免疫 腸道 炎癥

簡(jiǎn)介：事實(shí)上，魚在生命早期（2周）是透明的，與免疫細(xì)胞報(bào)告魚的生長(zhǎng)表相結(jié)合，可以在體內(nèi)對(duì)完整機(jī)體的免疫反應(yīng)進(jìn)行跟蹤。由于斑馬魚從受精卵發(fā)育，從生命開始就可以監(jiān)控免疫發(fā)育。在斑馬魚中，首先出現(xiàn)先天性免疫系統(tǒng)（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞），其次是適應(yīng)性免疫，從受精后的兩到三周開始發(fā)展。斑馬魚通常在受精后2天從絨毛膜孵化，盡管這取決于溫度。在較低溫度下生長(zhǎng)魚類會(huì)延遲孵化。第3天斑馬魚開口，整個(gè)胃腸管在受精后第6天開放。此時(shí)，卵黃囊被消耗，幼蟲開始進(jìn)食小原生動(dòng)物，如草履蟲。在幾個(gè)星期的過(guò)程中，腸道發(fā)展，同時(shí)幾個(gè)細(xì)菌物種殖民胃腸道。

斑馬魚胃腸道：硬骨魚類是極其多樣化和豐富的魚類群。當(dāng)討論魚的胃腸道時(shí)，需要提到的一個(gè)重要特征是胃的存在。在硬骨魚類中，我們可以找到有和沒有胃的魚。例如，尼羅羅非魚和大西洋鱈魚有胃，而河豚、百里香、鯉魚和斑馬魚缺乏胃。胃腺首先出現(xiàn)在大約4億5000萬(wàn)年前，似乎是大多數(shù)顎口（顎）脊椎動(dòng)物的特征。由于H+/K+ - ATPase（ATP4A和ATP4B）和編碼胃蛋白酶原的基因丟失，脊椎動(dòng)物的胃腺喪失（脊椎動(dòng)物腸的簡(jiǎn)化）發(fā)生了數(shù)次；斑馬魚不是胃，而是有前腸，稱為腸球，它比后部有更大的內(nèi)腔，因此可以作為與胃相媲美的儲(chǔ)層。然而，根據(jù)Nalband等人的研究，這種腸球缺乏胃腺，因此沒有低pH值。在穩(wěn)態(tài)條件下，斑馬魚腸道的pH值不低于7.5。斑馬魚的腸管形成始于體節(jié)中期至后期（18體節(jié)），而在哺乳動(dòng)物中，腸道在早期體節(jié)開始形成（1～2體節(jié)）。在18體節(jié)階段，一個(gè)連續(xù)的內(nèi)層薄層變得可區(qū)分，這將產(chǎn)生原始的腸內(nèi)胚層。盡管斑馬魚腸道形成較晚，腸管形成的時(shí)間順序是相同的。與哺乳動(dòng)物一樣，斑馬魚的喙腸首先形成，其次是后腸和中腸。腸道斑馬魚上皮層缺乏腸隱窩，然而，指狀突起稱為皺襞（絨毛），前部至后部的大小減小。發(fā)現(xiàn)不同分化的上皮細(xì)胞如吸收腸細(xì)胞（前腸和小腸）、黏液產(chǎn)生杯狀細(xì)胞（整個(gè)腸）和腸內(nèi)分泌細(xì)胞（前腸）。也沒有發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的微體細(xì)胞（M）細(xì)胞，雖然第四上皮細(xì)胞類型被確定在腸的后段，其中含有大量空泡，其中可以存儲(chǔ)腔內(nèi)容物。Payle的缺失和卵泡相關(guān)上皮的缺乏提示斑馬魚沒有M細(xì)胞，然而，上述M型空泡化細(xì)胞可能將管腔內(nèi)容傳遞給存在于上皮層之下的分散免疫細(xì)胞。與哺乳動(dòng)物相反，斑馬魚沒有粘膜下層。哺乳動(dòng)物的粘膜下層是一層疏松的結(jié)締組織，包含血液和淋巴管和神經(jīng)，位于粘膜下面（絨毛），將粘膜與下方的平滑肌層連接起來(lái)。在斑馬魚中，平滑肌層不那么復(fù)雜，直接附著在粘膜上。斑馬魚的腸神經(jīng)細(xì)胞體存在于圓形和縱向平滑肌層之間。像哺乳動(dòng)物一樣，上皮細(xì)胞從褶皺的底部遷移到細(xì)胞凋亡的褶皺頂端。BrdU染色顯示，這種遷移在前腸5～7天，中腸7～10天。與哺乳動(dòng)物一樣，上皮翻轉(zhuǎn)和分化依賴于微生物定植。有趣的是，在斑馬魚中控制上皮細(xì)胞向分泌譜系分化的機(jī)制似乎是高度保守的，在哺乳動(dòng)物中類似于Delta Notch信號(hào)。在沒有缺口激活的情況下，所有上皮細(xì)胞分化為分泌譜系的細(xì)胞。同樣，斑馬魚T細(xì)胞因子4（TCF4）在維持整個(gè)腸道的增殖性自我更新中是重要的。鑒于這種高功能同源性，斑馬魚是研究腸上皮更新機(jī)制的一個(gè)很好的模型。斑馬魚雖然沒有像哺乳動(dòng)物那樣的5個(gè)腸段（即空腸、十二指腸、回腸、盲腸（闌尾）和結(jié)腸），但它們具有功能同源性。在斑馬魚中，三個(gè)不同的腸段在形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)的基礎(chǔ)上被區(qū)分：前腸段（腸泡）、中腸和后腸段。消化酶強(qiáng)烈表達(dá)于最長(zhǎng)的皺褶的前段。這些消化酶和溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在在腸的前部和中部突出了這兩個(gè)片段中營(yíng)養(yǎng)吸收的功能。腸脂肪酸結(jié)合蛋白2在前腸和腸中部的表達(dá)最高，IFABP6主要表達(dá)于后腸。中腸的最后部分含有上述空泡狀（M型）細(xì)胞，這可能表明除了營(yíng)養(yǎng)吸收外，該區(qū)域可能在粘膜免疫中起作用。后部的上皮皺襞較短，這部分不含吸收的腸細(xì)胞，但很可能與水吸收有關(guān)。對(duì)成年斑馬魚的腸道進(jìn)行微陣列分析，將其分成7個(gè)等長(zhǎng)的段（從前1段到后7段）。

腸道微生物定植：地球上所有的動(dòng)物，無(wú)論是水生動(dòng)物還是陸地動(dòng)物，都與環(huán)境中的微生物共同進(jìn)化。從微生物生態(tài)學(xué)的研究進(jìn)展來(lái)看，微生物不僅寄生在宿主體內(nèi)，而且對(duì)宿主的生理和免疫也有很大的影響。反之亦然，宿主能夠控制哪些物種能夠在腸道內(nèi)定居，通過(guò)對(duì)某些進(jìn)行免疫應(yīng)答而耐受其他物種。在益生菌動(dòng)物中進(jìn)行的研究表明微生物對(duì)宿主有巨大的影響。微生物可以影響食品加工，使其他不消化的食物成分可供宿主使用。同樣，微生物可以合成維生素并刺激上皮更新。在這212個(gè)基因中，59個(gè)反應(yīng)在小鼠和斑馬魚之間是保守的。這些保守的基因主要參與上皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)代謝和先天免疫應(yīng)答。這表明對(duì)微生物的反應(yīng)部分是高度保守的。微生物通過(guò)處理不可觸及的食物成分來(lái)提高食物的能量吸收。在斑馬魚中，微生物的存在也會(huì)導(dǎo)致脂肪組織中脂肪的增加。微生物抑制血管生成素樣蛋白4（ANGPTL4/FIAF）的腸上皮表達(dá)。ANGPTL4/FIAF是脂蛋白脂肪酶的循環(huán)抑制劑，通過(guò)抑制抑制劑的定植導(dǎo)致脂肪的儲(chǔ)存。飲食誘導(dǎo)的微生物群組成的改變，如小鼠和人類，影響脂肪吸收和宿主能量平衡。微生物也誘導(dǎo)斑馬魚腸道發(fā)育。貝茨和同事發(fā)現(xiàn)，在沒有微生物群的情況下，斑馬魚腸上皮在分化過(guò)程中停止。他們觀察到缺乏刷狀腸堿性磷酸酶活性，表面上不成熟的糖蛋白表達(dá)模式和杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞的缺乏。此外，在沒有微生物的情況下，斑馬魚腸不能在小腸中攝取蛋白質(zhì)大分子。顯示腸內(nèi)容物的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間減少（更快的腸蠕動(dòng)）。用細(xì)菌定植這些魚逆轉(zhuǎn)了效果。有趣的是，無(wú)細(xì)菌斑馬魚暴露于細(xì)菌脂多糖（LPS）或熱滅活細(xì)菌可以重建堿性磷酸酶活性，但不影響對(duì)聚糖的表達(dá)，表明存在不同的宿主微生物反應(yīng)途徑。據(jù)報(bào)道，斑馬魚腸道中的上皮細(xì)胞增殖通過(guò)駐留微生物群的存在和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活來(lái)刺激。他們表明，穩(wěn)態(tài)先天免疫反應(yīng)，但不是炎癥信號(hào)有助于上皮增生的影響，因?yàn)槲⑸飳?duì)上皮細(xì)胞的周轉(zhuǎn)需要MYD88，而不是TNF受體。這也與小鼠發(fā)現(xiàn)一樣，細(xì)菌刺激誘導(dǎo)斑馬魚細(xì)胞中NF-κB（免疫基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子）。無(wú)菌性斑馬魚激活NF-κB的細(xì)菌定植及其在腸和腸外組織中的靶基因表達(dá)。在腸道菌群建立過(guò)程中，誘導(dǎo)刷毛酶堿性磷酸酶的表達(dá)。除了其在消化中的作用，表明缺乏堿性磷酸酶的斑馬魚對(duì)LPS毒性敏感，并且顯示腸中性粒細(xì)胞水平升高。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明微生物在斑馬魚腸道中形成中性粒細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)水平。對(duì)小鼠堿性磷酸酶活性的進(jìn)一步研究表明，它也具有先前未知的免疫功能。

適應(yīng)性免疫：在早期，斑馬魚完全依賴于它們固有的免疫系統(tǒng)，這使得在沒有適應(yīng)性免疫的情況下研究先天免疫過(guò)程。以前認(rèn)為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)直到4周后才成熟。因?yàn)樾叵俸皖^腎（初級(jí)免疫器官）在早期幼蟲階段仍然是基本的。斑馬魚胸腺僅從4 WPF開始獲得更復(fù)雜的形狀，髓質(zhì)中的TCRα恒定區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞在2～3 WPF中可見。在2 WPF時(shí)檢測(cè)到頭腎RAG-1的表達(dá)。原位雜交法報(bào)告9日齡斑馬魚食管和腸中的部分TCR陽(yáng)性細(xì)胞。總之，對(duì)于達(dá)到B和T細(xì)胞室功能成熟的年齡的證據(jù)仍然是有限的。LAM和同事們發(fā)現(xiàn)，在4 WPF之前，不能觀察到T細(xì)胞非依賴性和T細(xì)胞依賴性的免疫應(yīng)答（IgM）。表明斑馬魚免疫系統(tǒng)中的IgM反應(yīng)在形態(tài)和功能上成熟于4～6 WPF。然而，這些研究是在鑒定IGZ之前進(jìn)行的。IGZ-2轉(zhuǎn)錄物已經(jīng)檢測(cè)到2 WPF，這可能表明這種反應(yīng)的快速發(fā)展。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，目前比較安全的說(shuō)法是，在生命的前兩周，斑馬魚僅僅依靠先天免疫機(jī)制來(lái)防御。

先天免疫：抗菌肽（AMPS），由腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生，在幼蟲斑馬魚腸道形成第一道防線。AMPS是一種有效的廣譜抗菌藥物。AMPS是能殺死革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、包膜病毒、真菌甚至轉(zhuǎn)化或癌細(xì)胞的有效的廣譜抗菌劑。在斑馬魚中，與其他魚類一樣，一些基因被復(fù)制和多樣化，這可能導(dǎo)致這些細(xì)胞因子亞型的不同功能。有趣的是，與小鼠相反，斑馬魚具有CXCL8（IL-8），其與人CXCL8的功能相似。CXCL8是一種能吸引中性粒細(xì)胞的有效趨化因子。斑馬魚CXCL8在白細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中表達(dá)。已經(jīng)證明，CXCL8L1（CXCL8A）在腸中的表達(dá)隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化。檢測(cè)到在1 WPF和成人年齡（14 WPF）的低表達(dá)水平，但在5 WPF中在分散的粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞中的表達(dá)增加。在5 WPF的RAG1缺陷斑馬魚中，CXCL8A的表達(dá)增加，而原位雜交只顯示一些分散的細(xì)胞的染色，而它們的上皮細(xì)胞是陰性的。原始巨噬細(xì)胞也出現(xiàn)在血液循環(huán)開始之前。這些原始巨噬細(xì)胞遷移到大腦形成小膠質(zhì)細(xì)胞，但能夠吞噬并殺死被注射的細(xì)菌。標(biāo)記巨噬細(xì)胞的MPEG1轉(zhuǎn)基因斑馬魚特異性地顯示巨噬細(xì)胞存在，盡管在整個(gè)胚胎包括小腸的28 HPF中的數(shù)量較低，并且隨時(shí)間增加。最近，通過(guò)使用巨噬細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子α（TNFA）的轉(zhuǎn)基因株系，Nguyen Chi和同事報(bào)告了巨噬細(xì)胞亞群的存在。

腸道炎癥：為了充分利用斑馬魚的優(yōu)勢(shì)，有幾個(gè)群體使用斑馬魚幼蟲和成蟲開發(fā)了腸道炎癥模型。隨著不同的先天免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因報(bào)告魚的發(fā)展，首次在健康和腸道炎癥期間可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞募集。甚至在大多數(shù)轉(zhuǎn)基因斑馬魚可用之前，F(xiàn)leming和他的同事就用實(shí)驗(yàn)小鼠模型中的半抗原2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）開創(chuàng)了斑馬魚腸道炎癥的領(lǐng)域。從3到8 dPF，將魚浸泡在75μg/mL的TNBS中，觀察到擴(kuò)張的腸腔，腸皺襞（絨毛）消失，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加和5 DPF的上皮細(xì)胞出現(xiàn)上皮壞死因子α（TNF-α）陽(yáng)性染色。強(qiáng)的松和5-氨基水楊酸是IBD患者的兩種藥物，改善了斑馬魚幼蟲中TNBS誘導(dǎo)的疾病。這證實(shí)了與人類疾病狀態(tài)相關(guān)的腸道生理學(xué)和病理學(xué)可以在斑馬魚幼蟲中進(jìn)行建模。浸泡在TNBS溶液中（50μg/ml 3天）的幼蟲表現(xiàn)出明顯的促炎標(biāo)記物MMP9和白細(xì)胞增多。由于幼蟲浸泡不僅會(huì)對(duì)腸道造成損害，而且會(huì)對(duì)皮膚造成損害，因此他們優(yōu)化了方案，僅誘導(dǎo)腸道損傷而無(wú)皮膚損傷。幼蟲暴露于75μg/ml TNBS三天，表現(xiàn)出廣泛的皮膚損傷。暴露于低劑量TNBS或75μg/ml劑量的幼蟲在三天內(nèi)未出現(xiàn)皮膚損傷。在TNBS暴露的幼蟲中觀察到增殖細(xì)胞數(shù)量的顯著增加。，與小鼠和人類一樣，小腸結(jié)腸炎依賴于微生物群和Toll樣受體信號(hào)，因?yàn)榍贸齅yD88導(dǎo)致TNBS暴露的死亡率增加。在后續(xù)研究中，奧赫勒和他的同事們用DSS開發(fā)了另一種小腸結(jié)腸炎模型，并將小腸結(jié)腸炎與TNBS誘導(dǎo)的小腸結(jié)腸炎進(jìn)行了比較。DSS模型，如TNBS模型顯示嗜中性粒細(xì)胞炎癥，依賴于微生物。然而，DSS模型也顯示出與TNBS誘導(dǎo)模型的顯著差異：DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎顯示細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，因?yàn)閺恼麄€(gè)幼蟲勻漿中的細(xì)菌計(jì)數(shù)比未處理或TNBS處理的幼蟲在暴露3天之后顯示出更高的計(jì)數(shù)。暴露于TNBS后3天暴露的一氧化氮（NO）的增加在幼蟲暴露于DSS時(shí)是不可見的。

結(jié)論：斑馬魚模型不僅可以用于研究人類疾病的潛在途徑，它還可以作為研究水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類如大西洋鮭魚食物誘發(fā)腸道炎癥的一個(gè)重要模型。