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摘要：繁殖與營養(yǎng)狀況和能量儲備密切相關(guān)。在哺乳動物中，瘦素被認(rèn)為是能量平衡和生殖之間的聯(lián)系。然而，它在魚類繁殖中的作用仍不清楚。在這項研究中，我們使用功能喪失的瘦素受體 (lepr) 品系研究了瘦素在斑馬魚繁殖調(diào)節(jié)中的可能作用。瘦素信號受損導(dǎo)致雌性斑馬魚嚴(yán)重的生殖缺陷。與野生型雌性相比，lepr突變雌性產(chǎn)卵明顯減少，受精率低。卵泡發(fā)生不受影響，但 lepr 突變體中卵母細(xì)胞成熟和排卵被打亂。有趣的是，突變雌性垂體中促黃體生成素β（lhb）的表達(dá)顯著降低。對卵巢和分離的成熟卵泡中候選基因的分析顯示，突變體中參與類固醇生成、卵母細(xì)胞成熟和排卵的基因表達(dá)差異，已知這些基因受LH信號調(diào)節(jié)。此外，通過給予人絨毛膜促性腺激素，可以部分恢復(fù)lepr突變體的生育能力低下。我們的結(jié)果表明，瘦素缺乏并不影響卵泡發(fā)育的早期階段，但瘦素可能在后期階段是必不可少的，例如在卵母細(xì)胞成熟和排卵過程中。據(jù)我們所知，這是首篇有關(guān)瘦素與斑馬魚的生殖缺陷的研究。

關(guān)鍵詞：瘦素  斑馬魚  生殖  促黃體生成素  排卵  卵母細(xì)胞成熟

簡介：與其他脊椎動物一樣，魚類的繁殖是一個需要能量的過程，由腦-垂體-性腺 (BPG) 軸協(xié)調(diào)。硬骨魚可以將其近一半的能量儲備用于維持正常的生殖功能，而用于生殖的能量消耗水平在雌性中通常較高，用于產(chǎn)生卵子，而雄性的精子生產(chǎn)通常需要較少的能量。BPG軸的功能由幾個代謝因素控制，這些因素可以直接或間接作用于軸的所有三個水平。在哺乳動物中，其中一個因素是脂肪細(xì)胞衍生的激素瘦素，這是一種由肥胖 (ob) 基因編碼的 16kD 蛋白質(zhì)產(chǎn)物，主要但不完全在白色脂肪組織中產(chǎn)生。瘦素通過其受體 (lepr) 介導(dǎo)其信號，該受體屬于 I 類細(xì)胞因子受體家族。瘦素是體重、食欲和新陳代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，對哺乳動物生殖系統(tǒng)至關(guān)重要。缺乏功能性瘦素會阻礙青春期發(fā)育并導(dǎo)致不育，如瘦素缺乏的ob/ob小鼠。盡管哺乳動物和硬骨魚瘦素基因具有低水平的同源性，但蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)以及基因同線性似乎是高度保守的。近幾十年來，硬骨魚瘦素的研究主要集中在食欲、食物攝入和能量代謝方面，而有關(guān)其在生殖方面作用的信息仍然有限。幾項研究表明，瘦素在魚類成熟過程的后期可能很重要。 例如，雄性和雌性香魚產(chǎn)卵期間和產(chǎn)卵后的血漿瘦素水平較高。北極紅點(diǎn)鮭肝臟中的瘦素 mRNA 季節(jié)性增加，在秋季達(dá)到峰值，此時所有魚類也都性成熟。在雌性大馬哈魚中，將魚從海水轉(zhuǎn)移到淡水后瘦素的轉(zhuǎn)錄物和血漿水平與性類固醇水平的增加有關(guān)，刺激性成熟。此外，與未成熟魚類相比，成熟雄性大西洋鮭魚的肝臟lepa-1轉(zhuǎn)錄物更高。雄性鯖魚在青春期過渡期間肝 lepa 表達(dá)也上調(diào)，但雌性鯖魚沒有。在整個精子發(fā)生的中后期也觀察到雄性大西洋鮭睪丸中 lepr 轉(zhuǎn)錄物的顯著上調(diào)。在最近一項關(guān)于雌性鮐魚的研究中，瘦素刺激強(qiáng)烈誘導(dǎo)性腺激素分泌，促進(jìn)卵巢發(fā)育，并觸發(fā)雌性的青春期開始，這表明瘦素是激活生殖軸的重要信號。到目前為止，關(guān)于瘦素在斑馬魚繁殖調(diào)節(jié)中的作用知之甚少。斑馬魚有兩個瘦素基因（lepa和lepb），分別主要表達(dá)于肝臟和性腺，還有一個單一的lepr基因，在大腦和睪丸中表達(dá)最強(qiáng)。在Michel等人的一項研究中，缺乏功能性lepr的成年斑馬魚表現(xiàn)出正常的生育能力，該突變型既不影響受精卵的產(chǎn)卵數(shù)量，也不影響成功繁殖的頻率。根據(jù)我們的實(shí)驗室觀察，交配的雄性和雌性lepr突變斑馬魚沒有或很少有可存活的后代。在本研究中，我們旨在利用功能喪失的lepr斑馬魚品系，深入了解瘦素在成年斑馬魚繁殖調(diào)節(jié)中的作用。我們的數(shù)據(jù)表明，缺乏瘦素信號會導(dǎo)致雌性斑馬魚的生育能力受損。我們提供的證據(jù)表明 lepr 突變斑馬魚的黃體生成素 (LH) 轉(zhuǎn)錄水平較低，這也導(dǎo)致排卵卵泡的比例較低。與野生型雌性相比，參與類固醇生成、卵母細(xì)胞成熟和排卵的基因在 lepr 突變體中表現(xiàn)出差異表達(dá)，這表明瘦素在斑馬魚卵母細(xì)胞成熟和排卵的最后階段起著至關(guān)重要的作用。

lepr缺乏導(dǎo)致雌性生育能力受損：與對照組的野生型雌性相比，突變體雌性的產(chǎn)卵頻率較低，產(chǎn)卵量也顯著減少，無論是在總產(chǎn)卵量還是每次產(chǎn)卵量上，盡管無統(tǒng)計學(xué)差異。變異品系雌性產(chǎn)下的卵中，有很多質(zhì)量很差，外觀呈黑色，但在對照組中則不明顯。與對照組相比，該組的受精率也較低。但受精胚胎的存活并沒有受到影響。與對照組相比，與lepr突變雄性交配的野生型雌性在測量的生育參數(shù)上沒有表現(xiàn)出任何差異。總之，瘦素信號受損對斑馬魚的雌性生育能力有明顯影響，而在雄性中，精子形成沒有受到影響。

圖 1、 野生型和lepr突變型雌性斑馬魚的生育力評估

lepr缺乏對雌性的體型和體重沒有影響：lepr 突變雌性斑馬魚的體型比野生型雌性斑馬魚長，但兩種基因型之間的體重和體重指數(shù)均未發(fā)現(xiàn)顯著差異。

圖 2、 lepr+/+和lepr?/?成年雌性斑馬魚的標(biāo)準(zhǔn)體長 (A)、體重 (B) 和體重指數(shù) (C)。

lepr缺乏雌性斑馬魚的卵泡發(fā)生不受影響：組織學(xué)分析表明野生型和lepr突變型斑馬魚的卵巢中都可以識別出所有不同階段的卵泡[初級生長（PG）、前卵黃形成（PV）、早期卵黃形成（EV）、中期卵黃形成（MV）完全成熟（FG）]。與對照組相比，lepr突變魚卵巢中EV和FG卵泡的比例略高，但不顯著高于對照組，且兩種基因型之間卵泡發(fā)育不同階段的比率無統(tǒng)計學(xué)顯著差異。在卵泡生長過程中，卵黃素在雌二醇的控制下在肝臟中合成，通過血流輸送到卵巢并被生長中的卵母細(xì)胞吸收。在肝臟中測量了所有已知的雌激素受體亞型（esr1、esr2a、esr2b）和卵黃蛋白原基因家族的兩種亞型（vtg1、vtg2）的表達(dá)。在兩種基因型之間，這些基因的mRNA表達(dá)沒有顯著差異。綜上所述，這些結(jié)果表明lepr缺乏對斑馬魚卵黃發(fā)生和卵泡發(fā)生均無影響。

圖 3

、lepr+/+ (A) 和 lepr-/- (B) 成年雌性斑馬魚卵巢的組織學(xué)。

lepr 缺乏降低 lhb 轉(zhuǎn)錄：腦中促性腺激素釋放激素（GnRH）亞型（gnrh2，gnrh3）及其受體和垂體中卵泡刺激素（FSH）（gnrhr2，gnrhr3，fshb）的mRNA表達(dá)在野生型和lepr基因敲除雌性之間沒有顯示出任何顯著差異。然而，突變雌性的垂體中的促黃體激素 (lhb) 轉(zhuǎn)錄物顯著降低。在大腦和垂體中，兩組之間的lepr mRNA表達(dá)沒有差異。

卵巢組織和成熟卵泡中的差異基因表達(dá)：對成熟卵泡進(jìn)行取樣的過程中，我們觀察到，與野生型雌性相比，lepr突變雌性的卵巢形態(tài)更加異質(zhì)：lepr突變雌性的卵巢以完全或部分無排卵為特征，而野生型卵巢的排卵正常。因此，將突變體的完全生長卵泡分為兩組：完全不排卵的魚和部分排卵的魚。為了進(jìn)一步分析lepr突變雌性中觀察到的生育能力受損的分子機(jī)制，在lepr突變雌性的整個性腺和分離的成熟卵泡中評估了一組參與最終卵母細(xì)胞成熟和排卵的基因的表達(dá)譜，包括瘦素系統(tǒng)的基因，并與野生型雌性斑馬魚進(jìn)行了比較。

圖 4、lepr+/+ 和 lepr?/? 成年雌性斑馬魚的卵巢形態(tài)。

促性腺激素受體：lepr突變體和野生型斑馬魚卵巢中fshr和lhcgr的表達(dá)沒有差異。有趣的是，與完全不產(chǎn)卵的突變雌性相比，產(chǎn)卵的突變雌性成年卵泡中l(wèi)hcgr的轉(zhuǎn)錄物顯著更高。

類固醇酶：與野生型雌性相比，lepr突變雌性卵巢中的star和hsd3b1轉(zhuǎn)錄物更高。與未產(chǎn)卵的突變雌性相比，產(chǎn)卵的突變雌性成熟卵泡中 hsd3b1 的表達(dá)也顯著升高。孕酮膜受體：lepr突變體和野生型斑馬魚卵巢中mpra1（paqr7a）的表達(dá)沒有差異。然而，與未產(chǎn)卵的突變雌性相比，其在正在產(chǎn)卵的突變雌性成年卵泡中的表達(dá)明顯更高。兩種基因型的卵巢或成熟卵泡中mpra2（paqr7b）的轉(zhuǎn)錄本均無差異。與突變體相比，野生型魚類卵巢中的mprb（paqr8）轉(zhuǎn)錄物更高，盡管不顯著。孕酮受體膜成分：卵巢中 pgrmc1 的表達(dá)在對照組和突變組之間沒有差異。然而，野生型斑馬魚卵巢中的pgrmc2轉(zhuǎn)錄物高于lepr突變斑馬魚卵巢中的pgrmc2轉(zhuǎn)錄物。野生型魚類和兩個突變組在成熟卵泡中未觀察到兩個基因的顯著差異。孕酮核受體：與對照組相比，突變斑馬魚卵巢中pgr的表達(dá)水平幾乎高出2倍。與未產(chǎn)卵的突變雌性相比，產(chǎn)卵的突變雌性的成熟卵泡中觀察到顯著更高的轉(zhuǎn)錄物。前列腺素及其受體：兩種突變型之間催化斑馬魚前列腺素合成的環(huán)氧化酶（ptgs1、ptgs2a和ptgs2b）的轉(zhuǎn)錄物均無顯著差異。然而，ptger4b（一種已被證明在斑馬魚排卵中必不可少的前列腺素受體）的轉(zhuǎn)錄本在突變雌性的卵巢中顯示出顯著更高的水平。野生型魚類和兩個突變組之間，在成熟卵泡中未觀察到上述所有基因的顯著差異。金屬蛋白酶： mmp2 和 mmp15a 轉(zhuǎn)錄物在 lepr 突變體卵巢中上調(diào)，盡管差異僅在mmp15a中顯著。在成熟卵泡中未觀察到這些基因的表達(dá)差異。其他測定的金屬蛋白酶（mmp9、mmp14b、adamts1、adamts9）也沒有發(fā)現(xiàn)差異。其他參與卵母細(xì)胞成熟和排卵的基因：與對照組相比，突變斑馬魚卵巢中 cpla2 的表達(dá)水平顯著升高。相反，野生型斑馬魚卵巢組織中 ybx1 的表達(dá)高于 lepr 突變魚的卵巢組織。當(dāng)在完全生長的卵泡樣本中測試這些基因時，沒有觀察到顯著差異。卵巢和成熟卵泡中ctsl1、timp2b和mettl3的表達(dá)在各組之間沒有差異。瘦素系統(tǒng)基因：lepr和lepb的轉(zhuǎn)錄物在卵巢和發(fā)育成熟的卵泡中均有表達(dá)，但在不同基因突變型之間的表達(dá)沒有差異。

hCG可部分恢復(fù) lerp-/- 雌性斑馬魚的生育能力低下：為了研究在 lepr 突變體垂體中觀察到的 LH 水平較低是否可能是導(dǎo)致生育能力低下的因素之一，lepr-/- 雌性斑馬魚腹膜內(nèi)注射了 LH 激動劑 hCG。事實(shí)上，在給予 hCG 后，在lepr-/- 斑馬魚的卵巢中觀察到排卵卵泡數(shù)量顯著增加。當(dāng) lepr-/- 雌性與野生型雄性交配時，hCG使產(chǎn)卵成功率提高了 25%。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了我們最初的假設(shè)，即低排卵率可能是由 lepr 突變體中 LH 水平降低引起的，而產(chǎn)卵可能僅部分受 LH 信號的影響。

結(jié)論：我們的研究表明，瘦素信號受損會導(dǎo)致雌性斑馬魚出現(xiàn)嚴(yán)重的生殖缺陷。與野生型雌性相比，lepr 突變雌性lhb表達(dá)較低，這一發(fā)現(xiàn)表明瘦素可能在垂體水平調(diào)節(jié)LH，這在其他脊椎動物中也可以觀察到。這一假設(shè)進(jìn)一步得到了以下發(fā)現(xiàn)的支持：突變雌性的排卵障礙可以通過服用hCG來挽救。由于瘦素信號受損，LH水平降低將導(dǎo)致類似于lhb基因敲除斑馬魚的表型，在這種斑馬魚中，卵泡發(fā)育正常，但卵母細(xì)胞無法成熟并從卵巢排卵。此外，硬骨魚類中受LH調(diào)節(jié)的幾個與類固醇生成、卵母細(xì)胞成熟和排卵相關(guān)的基因在lepr突變雌性的性腺中有差異表達(dá)。據(jù)我們所知，這是將瘦素與硬骨魚物種的生殖缺陷聯(lián)系起來首次體內(nèi)研究。 然而，我們對瘦素在魚類繁殖中的作用的理解仍然有限。到目前為止，在硬骨魚的性腺水平上受損的瘦素信號傳導(dǎo)的直接影響仍然未知。對野生型和lepr突變斑馬魚卵泡發(fā)育的不同階段進(jìn)行全面的轉(zhuǎn)錄組分析可以對可能的機(jī)制提供更多的見解。

原文出自：Impaired leptin signaling causes subfertility in female zebrafish - ScienceDirect