大动物实验-动物试验中心-临床前研究「江苏美凤力医疗科技有限公司」

摘要：慢性疾病和造血障礙與炎癥小體的失調有關。我們小組最近報道了炎癥小體在造血干細胞和祖細胞分化中的相關性。然而，骨髓細胞炎癥小體在造血調節中的影響在很大程度上是未知的。在這項研究中，我們利用斑馬魚模型的獨特優勢證明，對巨噬細胞炎性體的遺傳抑制導致皮膚炎癥仔魚中巨噬細胞數量增加，而不影響紅細胞和中性粒細胞計數。同樣，通過相同的策略抑制中性粒細胞炎性體，導致皮膚炎癥仔魚中中性粒細胞數量增加，但不影響紅細胞和巨噬細胞。在這個模型中，中性粒細胞炎癥小體的過度激活促進了中性粒細胞的死亡，可以通過藥物抑制Gasdermin E來恢復。得出結論，骨髓炎性體通過斑馬魚中的 Gasdermin E 依賴性途徑自主調節慢性炎癥中的細胞焦亡。

關鍵詞：炎癥  細胞焦亡  造血  髓細胞  Asc  Gbp4  Caspase-1 

簡介：炎癥小體是一組多蛋白復合物，通過模式識別受體（PPR）檢測損傷相關分子模式（DAMP）和病原體相關分子模式（PAMP），通過 Gasdermin D 和 Caspase-1、-4、-5、-11 介導類花生酸產生、促炎細胞因子分泌和細胞焦亡來調節先天免疫反應。慢性炎癥、造血障礙和衰老與炎癥小體的失調有關。NLRP3 炎癥小體的失調與多種慢性疾病有關，例如動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎和阿爾茨海默病。然而，炎癥小體也可能在自身免疫性疾病和癌癥中具有保護作用。在炎癥期間，中性粒細胞和巨噬細胞被激活并被募集到炎癥的組織中。 中性粒細胞是人體中最豐富的循環白細胞，在急性炎癥反應中發揮重要作用，因為它們被迅速激活并首先到達炎癥部位。巨噬細胞是由活化的循環單核細胞產生的，這些單核細胞離開血液滲入組織并極化成兩種表型：增強炎癥的 M1 或促進組織修復的 M2。兩種免疫細胞都與適應性免疫細胞合作，在炎癥和消退之間取得平衡。 一旦危險信號消失，巨噬細胞就會吞噬死亡的中性粒細胞和其他死亡細胞，以恢復體內平衡。 然而，當缺乏協調時，就會發生免疫紊亂。典型的斑馬魚炎癥體由三種通過同型相互作用的成分組成：傳感器、適配器蛋白和酶原形式的效應器半胱天冬酶。鳥苷酸結合蛋白 (Gbps) 也是斑馬魚炎癥小體的一部分，例如需要 Asc 才能發揮活性的 Gbp4。我們利用斑馬魚模型的獨特優勢進行體內成像以及化學和遺傳操作，以闡明慢性皮膚炎癥模型中中性粒細胞和巨噬細胞中組織特異性炎性體抑制的后果。

抑制巨噬細胞炎癥小體導致斑馬魚皮膚炎癥的巨噬細胞數量增加：為了研究炎癥期間巨噬細胞中炎癥小體的特異性抑制作用，我們使用T（mpeg1:Gal4.VP16）和Tg（UAS:AscΔCARD-GFP）表達巨噬細胞中炎癥小體適配器Asc的顯性陰性形式，然后使用CRISPR-Cas9對spint1a進行遺傳抑制以誘導皮膚炎癥。在Spint1a敲除的仔魚中發現了巨噬細胞數量增加以應對炎癥，中性粒細胞也是如此。

圖 1. 抑制巨噬細胞炎癥小體導致斑馬魚皮膚炎癥的巨噬細胞數量增加。(A) 用于抑制巨噬細胞炎性體的斑馬魚系示意圖。使用 綠色熒光心臟標記Tg (uas:ascΔCARD-GFP)篩選后代。（B，C）用對照或 spint1a crRNA/Cas9 復合物顯微注射單細胞期斑馬魚卵。在3dpf時，巨噬細胞（B）、中性粒細胞（C）和紅細胞（D）分別用中性紅、蘇丹黑和鄰二苯胺染色。

使用類似的遺傳策略抑制整個仔魚和造血干細胞和祖細胞 (HSPCs) 中的炎性體導致中性粒細胞和巨噬細胞數量減少，然后分析了巨噬細胞炎性體抑制對紅細胞和中性粒細胞數量的影響，發現兩者不受影響。

中性粒細胞炎癥小體的抑制導致斑馬魚皮膚炎癥的中性粒細胞數量增加：我們進行了類似的實驗，以分析抑制中性粒細胞炎癥小體對對照組和炎癥仔魚的影響。在 Tg(mpx:Gal4.VP16) 和Tg(UAS:AscΔCARD-GFP) 系使用髓過氧化物酶啟動子 (mpx) 在中性粒細胞中表達顯性陰性 Asc。結果表明，抑制中性粒細胞炎性體加重了Spint1a敲除仔魚的中性粒細胞感染。然而，通過血紅蛋白染色檢測的紅細胞生成沒有受到影響。

圖 2. 中性粒細胞炎癥小體的抑制導致斑馬魚皮膚炎癥的中性粒細胞數量增加。(A) 用于抑制中性粒細胞炎性體的斑馬魚系示意圖。使用綠色熒光心臟標記 Tg (uas:ascΔCARD-GFP)篩選后代。（B，C）用對照或 spint1a crRNA/Cas9 復合物顯微注射單細胞期斑馬魚卵。在 3 dpf 時，中性粒細胞 (B) 和紅細胞 (C) 分別用中性紅、蘇丹黑和鄰二苯胺染色。

為了進一步證實巨噬細胞和中性粒細胞炎性體在炎癥過程中的細胞自主作用，使用 Tg(runx1:Gal4.VP16) 和 Tg(UAS:AscΔCARD-GFP) 系抑制了造血祖細胞和干細胞 (HPSC) 中的炎性體。正如預期的那樣，抑制 HSPCs 中的炎性體導致對照仔魚中的中性粒細胞數量減少，證實了先前的結果。相比之下，炎癥繞過了抑制 HSPC 炎性體對中性粒細胞計數的影響，證實了在炎癥的仔魚中觀察到的巨噬細胞和中性粒細胞炎性體的細胞自主作用。

圖 3. HSPC 炎性體的抑制不會影響斑馬魚皮膚炎癥的中性粒細胞數量。(A) 示意圖顯示了用于抑制 HSPCs 炎性體的斑馬魚系。使用熒光綠色心臟標記 Tg (uas:ascΔCARD-GFP)對后代進行篩選。(B) 用對照或 spint1a crRNA/Cas9 復合物顯微注射單細胞期斑馬魚卵。 在 3 dpf 時中性粒細胞被蘇丹黑染色。

中性粒細胞炎性體的激活通過皮膚炎癥斑馬魚中的gasdermin E促進中性粒細胞的焦亡：進一步證實中性粒細胞炎性體在炎癥反應期間調節中性粒細胞數量的相關性，發現在中性粒細胞炎癥小體激活后，患有皮膚炎癥的斑馬魚幼體中中性粒細胞的數量減少，而對照組幼體中中性粒細胞的數量沒有減少。迄今為止的結果表明中性粒細胞和巨噬細胞炎癥小體的細胞自主效應，我們接下來分析了是否只在炎癥的仔魚中激活了骨髓細胞中的焦亡。TUNEL 分析顯示 Spint1a 敲除仔魚中的死細胞數量高于其野生型同胞。此外，Spint1a敲除仔魚皮膚中的lyz+/TUNEL+細胞（即死亡的中性粒細胞）急劇增加，但在CHT中沒有。值得注意的是，Spint1a敲除仔魚中性粒細胞炎性體的激活導致皮膚中TUNEL+中性粒細胞的數量增加，而CHT的中性粒細胞數量沒有改變。

圖 4. 中性粒細胞炎癥小體的激活促進斑馬魚皮膚炎癥的中性粒細胞焦亡。我們分別使用gasdermin Ea和Gsdmeb抑制劑Ac-CMK-SEVD和Ac-CMK-FEID進一步證實細胞焦亡參與炎癥仔魚的中性粒細胞死亡和所涉及的gasdermin，因為斑馬魚缺乏Gsdmd和Gsdme，其已被證明介導該物種的細胞焦亡。結果表明，兩種肽抑制劑都挽救了具有過度活躍的中性粒細胞炎性體的 Spint1a 敲除仔魚中的中性粒細胞數量。

圖 5. Gsdme 介導皮膚炎癥斑馬魚中性粒細胞焦亡。

討論：盡管炎癥小體與健康和疾病相關，但它對造血的調節作用卻很少受到關注。我們假設炎癥損傷（例如皮膚炎癥）激活中性粒細胞和巨噬細胞中的炎癥小體可能對造血產生影響，因為在炎癥性疾病中通常出現造血譜系偏差，并導致中性粒細胞增多和貧血。出人意料的是，在斑馬魚皮膚炎癥模型中，我們沒有發現中性粒細胞或巨噬細胞炎性體調節造血的證據，這表明造血的改變可以通過抑制典型炎性體來緩解。雖然這些結果強調了炎癥小體在HSPC的髓系-紅系譜系決定中的關鍵相關性，我們不能排除成熟骨髓細胞中炎癥小體的激活也可能參與其他實驗條件下的造血調節，從而導致通常與慢性疾病相關的中性粒細胞增多和貧血。我們的結果顯示，在炎癥小體基因失活后，中性粒細胞和巨噬細胞的數量增加，炎癥小體以細胞自主方式起作用，而基因激活則產生相反的效果。TUNEL 分析以及抑制斑馬魚 Gsdme 的兩個旁系同源物表明，皮膚炎癥仔魚中骨髓炎性體的激活導致 Gsdme 介導的細胞焦亡。值得注意的是，僅在患有皮膚炎癥的斑馬魚仔魚中觀察到中性粒細胞和巨噬細胞焦亡，這表明炎癥損傷對于激活這些細胞中的炎性體是絕對必要的。值得在未來的研究中研究由炎癥的角質形成細胞釋放的炎癥損傷，這是誘導中性粒細胞和巨噬因細胞焦亡而死亡所必需的。

圖 6. 顯示 Gsdme 介導的慢性炎癥期間巨噬細胞和中性粒細胞細胞焦亡的工作模型。在慢性炎癥期間，來自炎癥組織的炎癥信號到達造血組織并促進 HSPCs 分化為巨噬細胞和中性粒細胞。A) 中性粒細胞通過炎癥信號梯度被募集到炎癥的組織中，在那里它們發揮功能并因細胞焦亡而死亡，從而調節炎癥所需的中性粒細胞數量。B) 通過強制表達 DN-Asc 抑制中性粒細胞炎性體會損害細胞焦亡并導致中性粒細胞在炎癥組織中的積累。C) 通過強制表達 Gbp4 激活中性粒細胞炎性體進一步促進浸潤在炎癥皮膚中的中性粒細胞的焦亡，導致中性粒細胞清除。在巨噬細胞中也有類似的機制。盡管在伴有皮膚炎癥的仔魚的巨噬細胞中會誘導細胞焦亡，但在中性粒細胞中卻沒有。 因此，焦亡在中性粒細胞生物學中的相關性是非常有爭議的。例如，據報道小鼠中性粒細胞具有獨特的炎性體，不會引發細胞焦亡，并允許這些細胞在急性沙門氏菌感染期間維持 IL-1β 釋放。與之形成鮮明對比的是，在銅綠假單胞菌肺部感染的小鼠中報告了中性粒細胞焦亡。同樣，缺乏GSDMD的小鼠表現出中性粒細胞延遲死亡和增強宿主對細胞外大腸桿菌的防御能力。

總之，我們證明中性粒細胞和巨噬細胞炎癥小體通過 Gdsme 介導的細胞焦亡機制在慢性皮膚炎癥斑馬魚模型中以細胞自主方式調節它們的數量。然而，我們沒有發現在慢性皮膚炎癥期間通過激活中性粒細胞和巨噬細胞炎癥小體來調節造血功能的證據。

原文出自：Gasdermin E mediates pyroptotic cell death of neutrophils and macrophages in a zebrafish model of chronic skin inflammation - ScienceDirect