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摘要：腦源性神經營養因子 (BDNF) 在神經元生長和分化、神經元可塑性、學習和記憶中起關鍵作用。 我們使用 CRISPR/Cas9 技術構建了一個重要的 斑馬魚Bdnf 基因敲除突變系，并對其進行了分子和行為表征。盡管在形態學檢查中沒有發現明顯的缺陷，但與野生型同系胚胎相比，66% 的編碼基因和 37% 的 microRNA 在 bdnf-/- 中存在差異表達。我們深入研究了生物鐘通路，并證實了時鐘（arntl1a、clock1a 和 clock2）和時鐘控制（anaat2）基因的節律性表達的變化。通過行為測試驗證了 Bdnf 對斑馬魚生物鐘的調節作用，突出了 bdnf-/- 仔魚缺乏晝夜活動節律。通過藥物治療可挽救部分晝夜節律行為。 這里介紹的 bdnf-/- 斑馬魚系是第一個有價值且穩定的脊椎動物模型，用于研究 BDNF 相關的神經發育疾病。

關鍵詞：魚仔魚：bdnf基因敲除導致晝夜節律失調神經行為  分子神經科學  發育神經科學 細胞神經科學

簡介： 腦源性神經營養因子（BDNF）是一種小的分泌性蛋白質，屬于神經營養因子家族。自發現以來，BDNF一直被認為在中樞神經系統發育過程中對調節離散神經元群的分化和存活至關重要。通過結合兩類跨膜受體（泛神經營養因子 p75 受體和原肌球蛋白相關激酶 (Trk) 家族受體）發揮作用，對 TrkB 亞型具有較高的親和力。與這些分子的相互作用導致主要信號通路的激活，這些通路調節下游基因的表達，這些基因參與調節特定神經元靶細胞的生長、維持和存活。BDNF除了在神經系統發育中起到公認的作用外，還具有在學習和記憶過程中增強突觸可塑性的功能。大量證據表明，BDNF 在長期增強中發揮關鍵作用，突觸可塑性的一種形式被廣泛認為是研究長期記憶形成的細胞模型。BDNF 還參與調節晝夜節律。 它在嚙齒動物下丘腦的視交叉上核 (SCN) 有節奏地表達，BDNF 還參與調節晝夜節律。 它在嚙齒動物下丘腦的視交叉上核 (SCN) 有節奏地表達，并在光夾帶中起重要作用。迄今為止，關于BDNF作用的大部分可用信息都來自于在小鼠進行的研究，但整個情況尚未完全闡明。主要障礙是bdnf純合子缺失的早期產后致死性。因此，所有結果僅限于雜合子動物，這些動物沒有表現出明顯的表型受損。

BDNF在脊椎動物中非常保守，哺乳動物和魚類之間的序列同源性較高（>90%）。雖然Bdnf和其他神經營養因子已經在斑馬魚中進行了研究，但它們在魚類品系的機制層面上的研究卻很少。最近，這種神經營養素在斑馬魚的大腦再生、食欲和新陳代謝中發揮了作用。與哺乳動物相比，在斑馬魚中有可能產生可行的敲除突變體。在這項研究中，我們使用 CRISPR/Cas9 技術產生了一個具有穩定且可遺傳的純合 40 堿基對 (bp) 敲除的 bdnf-/- 斑馬魚系，并分析了突變體與對照的轉錄和行為表型。我們觀察到Bdnf突變體在游泳活動中表現出明顯的缺陷，這與Bdnf在運動和學習等復雜行為中的既定作用一致。差異表達分析（RNA-seq 和 qPCR）揭示了與晝夜節律系統有關的關鍵基因表達的改變。 此外，在本研究中，我們旨在研究 bdnf 突變仔魚體內的日常和晝夜節律活動。雖然突變體仔魚的光夾帶沒有受損，但在持續的黑暗中，節律性強烈減弱，表明Bdnf在晝夜節律活動中的作用。有趣的是，我們還發現一些參與調節時鐘基因表達的 miRNA 在突變體中表達不同。根據我們的研究結果，我們建議將 bdnf-/- 斑馬魚作為一種理想的脊椎動物模型，用于闡明 Bdnf 在復雜行為（如運動、進食和學習）以及抑郁和焦慮相關疾病中的作用。

斑馬魚bdnf-CRISPR/Cas9基因敲除：為了研究Bdnf在斑馬魚神經系統發育過程中的作用，我們構建了一個CRISPR/Cas9介導的敲除系，位于影響所有五種ORF基因亞型的起始密碼子下游Bdnf第2外顯子缺失40 bp。使用T7內切酶I（T7EI）檢測從微量注射胚胎中提取的基因組DNA，評估針對所選區域的gRNA誘變的效率。F0突變魚與野生型（wt）魚雜交。 雜合種群 (bdnf+/-) 培育一代 (F2) 以減少嵌合體和意外的脫靶突變。使用T7EI分析和Sanger測序，我們驗證了nova2基因中沒有突變，這是CRISPR設計工具預測的唯一脫靶基因。F3 代反映了 25% bdnf+/+、50% bdnf++/- 和 25% bdnf-/- 魚的孟德爾比率。對每種情況下的胚胎池總蛋白裂解物進行的Western印跡分析證實，Bdnf+/-魚中的Bdnf蛋白水平約為Bdnf+/+對照組的一半，純合Bdnf?/?中的Bdnf蛋白水平幾乎消失。雖然我們沒有預料到完整突變體的蛋白質裂解物中會有任何陽性信號，但我們在蛋白質印跡中觀察到一條微弱的條帶，這可能是由于母體 Bdnf 或異源抗 BDNF 抗體與其他神經營養因子的交叉反應。

圖 1. bdnf-/- 斑馬魚系的生成

因此，我們得出結論是我們成功地建立了穩定的、可遺傳的bdnf-/- 斑馬魚系。重要的是，在突變胚胎中未觀察到發育過程中的形態異常和致死性。雄性和雌性突變魚都能進入成年期，并表現出正常的繁殖成功率。

bdnf 敲除仔魚的行為：除了已知在神經元、存活和分化中的作用外，BDNF還在突觸可塑性的調節中發揮作用。因此，我們推測它的缺失可能會影響調節 bdnf 突變體運動活動的神經回路。 為了驗證這一假設，我們測量了受精后 4 天 (dpf) 仔魚對光刺激的反應。與bdnf+/+（n=32）對照仔魚相比，突變仔魚表現出運動缺陷，雜合子bdnf+/-（n=32）仔魚的活性顯著降低，純合子bdnf?/? n=32）仔魚的強烈運動抑制。通過三個參數來測量運動缺陷：光刺激后10分鐘內的總行程、速度和旋轉頻率。與 bdnf+/+ 仔魚所有三個測量參數相比，bdnf+/- 仔魚的減少并不顯著，而 bdnf-/- 仔魚影響嚴重。此外，在測試期間斑馬魚在箱內路徑的軌跡進行的分析表明bdnf?/? 仔魚表現出明顯的趨向性，，即動物傾向于避開箱的中心并趨向其邊緣或外圍移動 ，而 bdnf+/+ 和 bdnf+/- 仔魚無明顯邊緣趨向。由于趨向性是動物中一個經過充分驗證的焦慮指數，該結果也證實了Bdnf在斑馬魚應激相關行為中的作用。為了證明觀察到的表型與 Bdnf 的缺乏有關，我們通過用 10 μM 的 7,8-二羥基黃酮水合物 (7,8-DHF)（一種合成分子）處理 22 hpf bdnf-/- 胚胎進行了藥理學實驗 通過激活其 TrkB 受體來模擬 Bdnf 的作用。對 7,8-DHF 處理的 bdnf-/- 突變仔魚 (n = 32) 的行為測試表明，與 bdnf-/- 仔魚 (n = 89) 相比，運動活動的恢復具有統計學意義。這些結果證實，Bdnf缺乏會影響斑馬魚仔魚的運動活動和趨向性。

圖 2. bdnf+/- 和 bdnf-/- 斑馬魚仔魚的行為

圖 3. bdnf-/- 斑馬魚仔魚的藥理試驗測試

使用 RNA-seq 對 bdnf-/- 系進行差異基因表達分析：我們對 48 hpf bdnf-/- 突變體和 bdnf+/+ 胚胎進行了深度 RNA 測序 (RNA-seq)。每個樣本平均產生 2800 萬個短配對末端片段，其中大約 89% 被明確定位到斑馬魚基因組。我們使用 DESeq2 方法在 48 hpf bdnf-/- 突變體和 bdnf+/+ 胚胎之間鑒定出 2614 個上調基因和 1653 個下調基因，表明與 bdnf突變相關的顯著轉錄差異。值得注意的是，參與神經營養途徑的關鍵基因的不同表達水平的上調，例如Trk2a（主要Bdnf和Nt4/5受體）、Trk3a（Nt3受體）和p75（Ngf、Bdnf、Nt3、Nt4/5和Nt6/7的通用神經營養因子受體）。這一方面尤其具有吸引力，因為它可能表明，在bdnf缺失的遺傳背景下，神經元存活途徑（即Trk2a和Trk3a的上調）與死亡途徑（即p75的上調）在發育過程中發生了必要的再平衡。為了深入了解差異表達基因的功能，我們對上調和下調基因進行了基因本體論 (GO) 富集分析。我們確定了與bdnf通路相關的幾個類別，如神經系統發育和功能、光感受、游泳行為，以及有趣的生物鐘。這些結果證實了bdnf突變系誘導轉錄組水平上的生物學變化。

Bdnf 調節晝夜節律：為了驗證轉錄組學分析的結果，我們研究了8 dpf 的bdnf+/+和bdnf?/?仔魚在12:12明暗（LD）周期或恒定黑暗（DD）條件下時鐘和時鐘相關基因的表達模式。在突變仔魚中，ZT9處arntl1a表達水平的增加被顯著抑制。在DD條件下，正如預期的那樣，bdnf+/+仔魚保持了時鐘控制基因表達的節律模式，并顯示出光誘導基因per2和cry1a mRNA的顯著抑制。相反， bdnf ?/?仔魚， clock1a和clock2的表達譜在24小時內出現失常。參與褪黑激素合成和調節的時鐘控制基因在魚類晝夜節律計時系統中也發揮著重要作用。aanat2是松果體中催化褪黑素合成的酶，其轉錄水平在光照期開始時較低，然后升高，在夜間（ZT21）結束時達到峰值。

圖4. 斑馬魚仔魚生物鐘基因的晝夜表達水平

圖5、斑馬魚仔魚生物鐘控制基因的晝夜表達水平

討論：在這項研究中，我們研究了Bdnf在斑馬魚發育過程中的作用，通過使用專門編輯目標基因的最具創新性的技術CRISPR/Cas9系統產生40 bp敲除。在確認 bdnf 外顯子 2 中的選定突變導致 Bdnf 丟失后，我們分析了與 bdnf-/- 突變體相關的轉錄和行為表型，揭示了參與調節晝夜節律的關鍵基因的損傷。目前，關于Bdnf在晝夜節律調節中的作用的數據很少。本工作中描述的實驗使驗證轉錄組分析的結果成為可能，因為不同光刺激條件（即 LD 或 DD 周期）下的行為測試證實了晝夜節律的改變。22hpf的bdnf?/?仔魚經7,8-DHF處理發現當進行運動分析測試時，拯救部分突變表型，從而證實突變行為實際上是由于缺乏Bdnf蛋白。在動物模型中進行的體內實驗再現了人類疾病的特定特征，為理解該疾病的發育起源提供了機會。在神經發育背景下，斑馬魚代表了一種強大的生物學工具，用于研究與遺傳畸變相關的特定機制。在動物模型中模擬突變如何影響神經系統發育，對于突出抑郁癥和焦慮等神經疾病的潛在機制至關重要，這些疾病與Bdnf缺乏或晝夜節律改變密切相關。因為bdnf在脊椎動物中高度保守，推導出斑馬魚氨基酸序列與哺乳動物的同源基因91%相似，我們假設在我們的突變魚類中觀察到的分子和行為表型可能會進行臨床轉化。

以前的研究報道，小鼠bdnf突變體表現出負責運動、平衡和姿勢控制的前庭神經節神經元減少。在小鼠模型中，闡明BDNF作用的一個主要障礙是純合突變體在出生后的早期致死性，通常發生在出生后2天內；只有一小部分動物最多能活2-3周。到目前為止，所有可用的結果都來自于對雜合子動物的研究，這些雜合子動物已達到成年狀態，并且看起來有生育能力。由于少量的BDNF可能能夠發揮其自身的功能，因此完全敲除BDNF對于充分了解這種神經營養素發揮的許多生物學功能至關重要。構建的bdnf-/- 斑馬魚品系可以幫助彌補這一差距并提供新的見解。盡管我們對其生理學仍然知之甚少，但這里介紹的斑馬魚突變系能夠存活到成年期，并且可能解釋來自旁系同源基因所施加的“代償網絡效應”的激活，這些基因已被證明可以緩沖基因組編輯誘導的有害突變 。在 bdnf+/- 小鼠中，BDNF 在 SCN 中的顯著抑制表達和 DD 中光誘導的運動活動表明這種神經營養因子在調節光夾帶中起作用。在將外源性BDNF注入SCN改變對光脈沖的行為反應的大鼠試驗中也獲得了類似的結果。由于這一關鍵問題之前尚未研究過，我們還研究了Bdnf在斑馬魚生物鐘系統中的作用。

事實上，在突變體中，DD條件下的運動活動是失常的，并且通過藥物治療部分恢復了節律行為，證明了該模型的有效性。此外，DD 突變仔魚中 mRNA 表達模式的差異表明 Bdnf 對 clock1a 和 clock2（晝夜節律反饋回路的兩個正元件）以及編碼催化褪黑激素合成的酶 aanat2 的調節作用。魚類生物鐘的一個要點是松果體有節奏地合成和分泌褪黑素激素。褪黑激素在夜間產生，其產生速度取決于 AANAT 的酶活性。夜間高褪黑激素水平反映了 AANAT 合成和活性的增加，而白天褪黑激素產生的終止反映了這種酶的蛋白酶體降解。總體而言，這些數據首次在 bdnf-/- 斑馬魚仔魚中收集，為將 Bdnf 在晝夜節律中的多效性提供了一個新框架。 然而，需要進一步的實驗來確定可以直接或間接將 Bdnf 連接到分子生物鐘網絡的中間因素。靶向Bdnf-TrkB通路下游的特定Bdnf信號成分對于揭示這一有趣分子的復雜作用是必要的。

總之，我們描述了第一個可行的 bdnf-/- 脊椎動物模型，該模型為神經營養因子的分子和細胞機制提供了獨特的見解。我們證明斑馬魚幼體中的Bdnf對行為晝夜節律的產生至關重要，并能更好地進行人類神經發育和晝夜節律調節疾病臨床轉化。這項研究證實了 Bdnf 參與的眾多途徑，并且構建的斑馬魚突變系可作為未來研究的獨特工具，旨在了解 Bdnf 在不同生物過程中的作用，如神經元發育和突觸傳遞、視覺光感知、 再生和新陳代謝。

原文出自：Loss of circadian rhythmicity in bdnf knockout zebrafish larvae - ScienceDirect