TEL:17312606166（魏經理）
美鳳力臨床前大動物實驗中心
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眾所周知，CRISPR/Cas9系統可以用來操縱基因組：規律成簇的間隔短回文重復CRISPR與內切酶Cas9的組合，可以在引導RNA（gRNA）的指引下，靶向基因組中的特定區域并切割DNA，產生DNA雙鏈斷裂（DSB）。
自2013年，CRISPR/Cas9系統的應用又得到了更廣泛的擴展，我們可以將Cas9帶到特定的基因組位點，通過起始或停止轉錄來調控靶基因，達到激活或抑制基因表達的目的
實現這種轉變的核心仍舊是Cas9，只是編輯基因組需要具有內切酶活性的Cas9蛋白，而調節基因表達時需要催化功能失活的“dead”Cas9 —— dCas9。這種突變（D10A，H840A）的Cas9蛋白雖然不能進行DNA雙鏈的切割，但仍舊可以在gRNA的指導下與特定靶向的DNA緊緊結合。
當使用dCas9蛋白與不同的效應結構域連接，而gRNA與我們想要抑制或激活的靶基因區域互補時，我們就可以利用CRISPR/Cas9系統來調節靶基因的表達了。
CRISPRi也稱為CRISPR干擾 (CRISPR interference or inhibition) 。dCas9與轉錄抑制子連接，如KRAB（Kruppel associated box），dCas9-KRAB融合蛋白在gRNA指引下，結合到靶基因TSS位點，抑制轉錄起始，沉默靶基因的表達。
dCas9融合KRAB的CRISPRi系統（dCas9-KRAB）在海馬神經元中能有效地靶向抑制功能基因的表達，基因沉默水平顯著優于傳統RNAi技術。
利用神經元亞群特異性的啟動子條件性CRISPRi能精確控制功能基因Syt1在海馬齒狀回興奮性和抑制性神經元中喪失功能而不影響Syt1在其它類型細胞中的表達。
針對Syt1及其互作蛋白網絡的基因Syb2，Stx1a/b和SNAP25a的多重基因CRISPRi系統能夠在小鼠腦內實現靈活多變的多基因不同組合的高效失活。
最新的研究在dCas9-KRAB的基礎上進行優化，發現dCas9-KRAB-MeCP2能夠更高效地對靶基因表達的抑制。
參考文獻：
Zheng Y, Shen W, Zhang J, Yang B, et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):447-454.
Yeo NC, Chavez A, Lance-Byrne A, Chan Y，et al. An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation. Nat Methods. 2018 Jul 16. doi: 10.1038/s41592-018-0048-5.
CRISPRa也稱為CRISPR激活 (CRISPR activation) 。讓dCas9與不同的轉錄激活子結合發揮上調靶基因表達的作用。例如，直接與單個轉錄激活因子（例如dCas9-VP64或dCas9-VP16）融合表達，不過單轉錄激活因子對靶基因地激活水平降低。為了更好地提高過表達的水平，可將多個轉錄激活因子共同招募到靶基因TSS位點：如多拷貝VP64與dCas9的融合、三元轉錄激活因子VPR（VP64-p65-Rta）融合到dCas9末端。
除了將轉錄激活因子直接與dCas9融合以外，還可以通過分子掛鉤來招募轉錄激活因子到dCas9周圍，如：將SunTag短肽（含多拷貝的GCN4激活招募結構域）與dCas9融合，來招募scFvGCN4-sfGFP-VP64。或利用SAM系統，將MS2發夾結構融合到gRNA上，招募激活輔助蛋白（MS2-p65-HSF1）到dCas9-VP64融合蛋白上，提高激活效率。
圖4. CRISPRa系統示意圖。圖片來自: ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):406-416.
在今年初的Nature Neuroscience上，一種新的CRISPRa系統被建立并應用——dCas9-SPH。將SunTag-p65-HSF1與dCas9融合，并利用Cre-loxP系統，建立了一種可受Cre誘導的dCas9-SPH轉基因小鼠。
dCas9與轉錄激活因子融合轉錄增強結果顯示，融合三個轉錄激活因子的增強的效果明顯高于融合單個轉錄激活因子。
檢測人類293T細胞中的MIAT、NEUROD1、ASCL1、RHOXF2、TTN、ACTC1基因，結果顯示dCas9結合轉錄增強子對不同的基因激活程度不同。
Fig3. Gene activation using VPR.
參考文獻：
Chavez A, Scheiman J, Vora S, Pruitt BW, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods. 2015 Apr;12(4):326-8.
將SunTag-p65-HSF1 (SPH)融合到dCas9蛋白上，分別在人和小鼠的細胞里驗證了dCas9-SPH系統的高效性以及特異性。
Fig1. Design of an improved activator SPH.
Fig2. mCherry driven by a minimal CMV promoter was activated in HEK293T and N2a cells by the indicated dCas9 activation systems.
構建受Cre重組酶調控的dCas9-SPH轉基因小鼠，在dCas9-SPH小鼠的原代細胞里導入sgRNA可以激活基因和長鏈非編碼RNA。
Fig3. Generation of a Cre-dependent SPH transgenic mouse and activation of genes and lncRNAs in primary cells.
通過向dCas9-SPH轉基因小鼠腦部定點注射靶向三個轉錄因子（ANN）Ascl1，Neurog2、Neurod1的AAV-sgRNA，結果顯示ANN轉錄因子顯著上調，星形膠質細胞可以直接被轉化為功能性神經元。
Fig4. SPH-based targeted activations convert astrocytes into functional neurons in vivo.
向dCas9-SPH轉基因小鼠腦部定點注射靶向多個基因以及長鏈非編碼RNA的AAV-sgRNA陣列，可實現多個基因在神經元內的同時激活。Fig5. Complex transcriptional activation in the intact brain using a single sgRNA array.
參考文獻：
Zhou H, Liu J, Zhou C, Gao N, et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):440-446.
基因表達降低（Knockdown）：適用于編碼和非編碼基因。可與CRISPR-KO或RNAi互補。
基因過表達（Overexpression）：適用于編碼和非編碼基因。可實現基因在內源環境中過表達。
基因定位：dCas9與熒光蛋白融合表達，可以對靶基因所在的染色體定位進行示蹤。
誘導iPS：可利用CRISPRi來誘導iPS，或大規模篩選細胞全能性相關基因。
高通量遺傳篩選：可以利用CRISPRi/CRISPRa找到腫瘤細胞中的調節通路或易感基因、鑒定組織發育或細胞分化中的重要基因。
dCas9介導的基因調控是可逆的，不會永久性地修飾基因組DNA。
CRISPRi/CRISPRa復合物必須在轉錄起始位點附近才能發揮作用，因此降低了脫靶效應。
設計多條gRNAs可同時對多個靶基因進行調控。
CRISPRi的作用類似于RNAi，但又不同于RNAi。RNAi針對成熟的RNA，而CRISPRi則是在DNA水平阻止轉錄的起始。因此，與RNAi相比，可靶向lncRNA、microRNA、反向轉錄產物、細胞核內的轉錄本等，是研究非蛋白編碼基因的有力工具。
PAM序列在一定程度上限制了結合靶序列的數量。
染色體狀態和修飾可能會影響dCas9-gRNA與DNA的結合。
哺乳動物細胞中，不同基因的CRISPRi/CRISPRa的效率差異性較大。
當靶基因的靶序列與其它基因重疊，或受雙向啟動子調節時，CRISPRi/CRISPRa的調控可能會影響到周邊的基因表達。
dCas9介導的體內基因沉默/激活工具小鼠來啦！
南模生物dCas9系列工具鼠，可幫助研究者實現多靶點、可逆、內源蛋白編碼基因以及長鏈非編碼RNA的調控。
CAG-LSL-KRAB-dCas9
品系全名：C57BL/6J-Gt(ROSA)26Sorem1(CAG-LSL-KRAB-dCas9-IRES-EGFP)Smoc
目錄號：NM-KI-18007
品系描述：將CAG-LSL-2xKRAB-dCas9-IRES-EGFP-WPRE-pA定點插入到小鼠Rosa26基因中，建立受Cre表達誘導的CRISPRi基因表達調控工具小鼠。與Cre工具鼠交配后，在Cre表達的細胞內，可通過gRNA靶向并沉默目的基因。
CAG-LSL-dCas9-VPR
品系全名：C57BL/6J-Gt(ROSA)26Sorem1(CAG-LSL-dCas9-VPR-IRES-EGFP-WPRE-pA)Smoc
目錄號：NM-KI-18004
品系描述：將CAG-LoxP-STOP-LoxP-dCas9-VP64-p65-Rta-IRES-EGFP-WPRE-polyA結構插入到Rosa26基因中，建立受Cre表達誘導的CRISPRa基因表達調控工具小鼠。與Cre工具鼠交配后，在Cre表達的細胞內，可通過gRNA靶向并增強目的基因的表達。
TRE3G-dCas9-VPR
品系全名：C57BL/6J-Col1a1em1(TRE3G-dCas9-VPR-eGFP-pA)Smoc
目錄號：NM-KI-00123
品系描述：將TRE3G-dCas9-VP64-p65-Rta-eGFP-pA四環素調控表達dCas9激活元件插入到安全位點Col1a1位點中。與rtTA工具鼠交配后，可在強力霉素dox誘導下在rtTA表達的細胞中，通過gRNA靶向并增強目的基因的表達。
CAG-LSL-dCas9-SPH
品系全名：C57BL/6-Tg(CAG-LSL-dCas9-SPH)Smoc
目錄號：NM-TG-00025
品系描述：通過piggyBac轉座子系統建立CAG-LSL-dCas9-HA-SunTag-p65-HSF1-EGFP-WPRE-polyA轉基因小鼠。dCas9-SPH的表達受Cre重組酶調控，與Cre工具鼠交配后，在Cre表達的細胞內，可通過gRNA靶向并增強目的基因的表達。
參考文獻
Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83.
Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013 Jul 18;154(2):442-51.
Cheng AW, Wang H, Yang H, Shi L, et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 2013 Oct;23(10):1163-71.
Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, et al. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014 Oct 23;159(3):635-46.
Chavez A, Scheiman J, Vora S, Pruitt BW, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods. 2015 Apr;12(4):326-8.
Zalatan JG, Lee ME, Almeida R, Gilbert LA, et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 2015 Jan 15;160(1-2):339-50.
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Zhou H, Liu J, Zhou C, Gao N, et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):440-446.
Kampmann M. CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):406-416.
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