大动物实验-动物试验中心-临床前研究「江苏美凤力医疗科技有限公司」

《自然-通訊》（Nature Communications）在線發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心吳立剛研究組與南京醫科大學李建民研究組合作完成的最新研究成果（The non-redundant functions of PIWI family proteins in gametogenesis in golden hamsters）。該研究以金黃地鼠（Mesocricetus auratus，golden hamster）為動物模型，全面揭示了PIWI家族成員及其結合的piRNA在配子發生和早期胚胎發生中非冗余的調控功能，為研究哺乳動物piRNA功能奠定了重要基礎。

piRNA（PIWI-interacting RNA）是一類生殖細胞特異表達的非編碼小RNA，與PIWI蛋白形成效應復合體，參與轉座子沉默和基因表達調控，在配子發生和受精卵發育過程中發揮廣泛而重要的功能。以往對哺乳動物PIWI/piRNA的功能認識主要基于小鼠模型。然而，研究組的前期研究表明小鼠卵細胞中非編碼小RNA的組成在哺乳動物中不具有廣泛代表性，并首次在人和食蟹猴卵細胞中發現新的piRNA家族成員os-piRNA。近期，包括該研究組在內的三項獨立研究表明，piRNA通路重要作用蛋白PIWIL1和MOV10L1（RNA解旋酶）的缺失均可導致金黃地鼠雌雄不育，與小鼠中表型存在明顯差別。上述研究證明了小鼠不是研究哺乳動物雌性生殖細胞發育中piRNA功能的最佳動物模型，以往通過小鼠建立的哺乳動物piRNA經典結論需要在更加具有代表性的金黃地鼠中重新研究或加以確認。

針對上述科學問題，科研人員分別制備和獲得了四種PIWI蛋白的特異性抗體，結合超分辨共聚焦顯微技術，全面分析了四種PIWI亞家族蛋白在金黃地鼠精子發生、卵子發生和早期胚胎發育中的時空表達特征，并結合高通量測序技術細致地描繪了不同發育時期中PIWI蛋白所結合的piRNA表達譜。進一步，研究利用CRISPR技術分別構建了四種PIWI缺失的金黃地鼠突變系，探討了不同PIWI蛋白突變所引發的生殖缺陷表型。結果表明，PIWIL1同時在雌性和雄性生殖細胞及早期胚胎中高表達，主要結合29-30 nt piRNA，突變后導致雌雄均不可育：突變的生精細胞在進入雙線期前發生大量死亡，部分可進入雙線期的生精細胞隨后發育停滯，而突變的卵母細胞可正常發育，但受精后胚胎發育停滯于2細胞時期。PIWIL2和PIWIL4主要在生精細胞中表達，但兩者表達存在明顯的時期特異性，且分別結合27 nt或28 nt piRNA。PIWIL2或PIWIL4突變后生精過程嚴重受阻，大量精原細胞凋亡，造成雄性不育。PIWIL3高表達于卵母細胞和早期胚胎中，結合19 nt的os-piRNA，突變后卵母細胞發育正常，但受精后的胚胎發育遲緩，且大部分在發育過程中停滯或凋亡，最終導致生育能力顯著下降。

研究發現，PIWI蛋白功能存在明確的分工但又緊密聯系。在卵母細胞發育中，PIWIL1/piRNA可以代償PIWIL3/piRNA活性，抑制以LINE/L1和LTR/ERVK為主的活躍轉座子的表達，反之則不然。而在生精細胞發育過程中，PIWIL4入核功能及其相關piRNA的加工依賴于PIWIL2，兩者協同完成轉座子的轉錄水平和轉錄后水平沉默。

綜上，本研究使用更具代表性的金黃地鼠作為模型，全面繪制了PIWI家族各個成員在配子發生和早期胚胎發育中的時空表達譜，構建并比較了四種PIWI突變體的生育表型和分子表型，發現了四種PIWI蛋白在配子發生和早期胚胎發育中具有非冗余的調控作用，為piRNA通路異常與人類生殖相關疾病的診治奠定了重要理論基礎、提供了動物模型。

研究工作得到國家自然科學基金委員會、科學技術部、中國科學院、上海市和江蘇省的資助。研究工作獲得分子細胞卓越中心實驗動物技術平臺和信息化管理團隊的支持。南京醫科大學科研人員參與研究。