細(xì)胞轉(zhuǎn)染的基本原理是將外源的DNA克隆到載體上后導(dǎo)入細(xì)胞，借助宿主細(xì)胞表達(dá)載體上的目的片段，從而使目的基因在細(xì)胞中發(fā)揮功能。目前轉(zhuǎn)染方法有多種，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣-DNA共沉淀法、電穿孔轉(zhuǎn)染法、腺病毒感染等。
常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，另一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的外源DNA不整合到宿主的染色體中，通常表達(dá)只持續(xù)幾天，一般在轉(zhuǎn)染24-72小時(shí)后檢測(cè)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的外源DNA將整合到宿主染色體中，可持續(xù)性表達(dá)，一般用于穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建。
l 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（瞬轉(zhuǎn)）
1.載體構(gòu)建（可選），RNAi合成（視轉(zhuǎn)染情況而定）；
2.將細(xì)胞按照1~3x105接種到6孔板中，加入2~4mL的完全培養(yǎng)基，混勻放置在二氧化碳培養(yǎng)中，37℃過(guò)夜；
3.無(wú)菌狀態(tài)下配置如下液體：
a.用100μL的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋2μg的待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；
b.用100μL的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋25μL的Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑；
4.將a, b液混合并混勻，室溫放置15min；
5.細(xì)胞培養(yǎng)至80%單層左右，用Opti-MEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，每孔加入1mL Opti-MEM培養(yǎng)基，并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔中，按十字方向輕搖混勻，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
6. 4-6小時(shí)后將轉(zhuǎn)染液吸出，換為新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4天后檢測(cè)蛋白表達(dá)量。
l 腺病毒轉(zhuǎn)染（瞬轉(zhuǎn)）
1.腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建；
2.以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法包裝腺病毒，測(cè)其滴度；
3.不同MOI下測(cè)試得最佳轉(zhuǎn)染效率值；
4.使用最佳MOI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
l 慢病毒轉(zhuǎn)染（穩(wěn)轉(zhuǎn)）
1.慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建；
2.以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法包裝慢病毒，測(cè)其滴度；
3.不同MOI下測(cè)試得最佳轉(zhuǎn)染效率值；
4.使用最佳MOI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
5.進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選。
17312606166