大动物实验-动物试验中心-临床前研究「江苏美凤力医疗科技有限公司」

更新時間：2019-01-22, 來源：國家實驗動物專家委員會簡報 2019年第6期2062

與基因工程小鼠等動物制備相比，遺傳修飾NHP動物存在制備效率、操作難度、研究成本等多個瓶頸。以至于致在轉基因小鼠出生后近20年后，才獲得世界上首例綠色熒光蛋白轉基因猴[23]。但是，ZFNs、TALENs和CRISPR/cas9等高效基因編輯技術的成熟和應用，促使NHP基因編輯動物制備進入了快車道，亨廷頓舞蹈病、帕金森病、抑郁癥等NHP疾病動物模型相繼誕生[24,25]。

但是，對糖尿病而言，目前尚無相關NHP基因工程動物制備的研究報道。我們認為，制備基因工程NHP糖尿病模型動物可能存在以下幾方面限制：一是臨床發現，90%以上2型糖尿病患者表現為基因表達改變而非基因編碼改變[26-28]，雖然已證實某些T2DM患者的單基因突變是致病原因，但點突變患者在T2DM發病人群中的比例較低，因而基于該突變位點制備的基因工程動物在臨床上的代表性存疑；二是人們利用全基因組關聯分析（Genome-wide association studies, GWAS）在T2DM上發現了100多個關聯SNP[26-28]，顯然要對如此多的DNA位點進行遺傳操作，目前還存在技術困難。此外，靈長類動物的世代間隔長（5~6年），且為單胎，即使獲得了能穩定遺傳的糖尿病模型小樣本，按照小鼠模型培育需要8~10代[29]計算，種群培育的漫長周期，使得該途徑的可行性和實用性也大受影響。

（四）糖尿病易感NHP種群的篩選和建立

臨床流行病學調查發現，對于糖尿病遺傳家族人群，如果合理飲食及運動，可能減少疾病發生；相反，非糖尿病敏感人群，如果長期攝入高糖、高脂食物，且不注意運動等活動，也可能增加患病風險。也就是說，糖尿病是遺傳因素和環境因素共同作用的結果[26-28]。根據糖尿病的上述特征，目前培育的糖尿病模型動物種群（如kkay小鼠、DZF大鼠等）主要通過表型選育獲得。

正如前面上述，NHP自然發病動物多為中老年，且兼具世代間隔長和單胎等特點，表型選育難以形成穩定遺傳的種群。

最近，我們實驗室利用人T2DM的遺傳數據，通過生物信息學挖掘——基因組映射——特定靶點高通量測序這一嶄新途徑，獲得了猴T2DM關聯SNP；建立了猴T2DM遺傳風險評估模型；篩選建立了T2DM易感猴繁育種群。

首先，利用人T2DM的遺傳數據，通過生物信息學分析，挖掘到可能人T2DM關聯的基因組片段276個，將其映射到食蟹猴基因組。采用均衡病-健小樣本（82/85）對上述特定靶點進行高通量測序，得到與T2DM關聯的SNPs共99個。利用99個關聯SNPs建立猴T2DM遺傳風險評估模型，模型的預測結果與動物實際表型一致性為79.64%（133/167）；而以關聯程度最高的30個SNPs進行T2DM風險評估，其結果與99個SNPs基本一致。

進一步對兩種遺傳預測模型的風險系數進行統計分析，結果發現，當風險系數在0.4~0.6之間時，預測結果與動物實際表型差異較大（一致性約為62%~65%）；而當風險系數≤0.4或者≥0.6時，預測結果與動物實際表型的一致性顯著提高（大于80%）。基于上述統計結果，我們提出了T2DM易感猴的評價標準為：對99個SNPs位點進行測序，當99-SNPs和30-SNPs的風險系數同時≥0.6，該動物為T2DM易感個體；當兩種模型獲得的風險系數同時≤0.4，該動物為T2DM不敏感個體。利用該標準對所測試的167只猴進行分析，預測結果與實際表型的一致性超過85%。

最后，從所測試的表觀正常猴中挑選T2DM高風險動物8只、中度風險動物6只（99-SNPs或30-SNPs的風險系數為0.4~0.6）和低風險動物13只，同時飼喂高能量飼料32 w。高風險動物在20 w左右開始出現高血糖表型，最終6只猴出現糖尿病病變（75.0%，6/8），1只猴雖然血糖值仍在正常水平，但糖耐量受損（12.5%，1/8），而另1只猴糖代謝正常（12.5%，1/8）；6只中度風險動物，1只出現糖尿病病變（16.7%，1/6），3只僅表現糖耐量受損（50.0%，3/6），2只動物糖代謝正常（33.3%，2/6）；而13只低風險動物，糖代謝全部正常。

目前，課題組測試了334只中青年繁殖猴，獲得了86只（在猴群中的比例為25.75%）T2DM遺傳高風險猴（即99-SNPs和30-SNPs風險系數同時≥0.6的動物）。其中雌性75只，雄性11只，根據雌雄動物SNP位點的基因型，86只T2D高風險猴組成了10個繁殖單元。

關聯SNP研究以及遺傳風險篩選為T2DM等復雜遺傳性疾病NHP模型動物種群建立提供了新途徑，但種群的遺傳穩定性還需要后代表型分析支持。課題組將及時對T2DM敏感猴群的后代進行測試，以檢驗該方法的可靠性。

三、非人靈長類動物糖尿病模型種群的標準化研究

與人T2DM發病進程一樣，NHP動物在疾病不同階段展現不同特征，到疾病后期，因高糖損傷而導致的心腦血管系統、腎臟組織等綜合癥將直接威脅到動物生命。因此，猴群定期監測、飼養標準、發病動物護理是種群標準化研究的重要內容。

（一）NHP糖尿病模型種群監測

1、空腹血糖：盡管不斷有T2DM新的診斷指標被報道，但空腹血糖值仍然是糖尿病最直接的診斷標準。對人而言，WHO標準為：當空腹血糖≥7.0 mmol/L時為顯性糖尿病；餐后2 h血糖值>7.8 mmol/L時，為糖耐量受損。

而猴子等NHP動物的血糖值目前尚無統一標準。對正常猴與健康人群的血糖值比較發現，NHP動物的血糖值通常較人低1.0~1.77 mmol/L。因此，猴的空腹糖>5.6 mmol/L時，即可能患病[30]。但也有研究報道認為，以人的指標（即空腹血糖≥7.0 mmol/L）作為猴糖尿病依據更準確[20]。

與人不同的是，動物的空腹血糖容易受操作過程影響。比如劇烈的保定操作以及麻醉劑都可能導致血糖值異常波動。對于猴子等NHP動物，目前主要采用兩種方法確認動物的實際血糖值。一是不同時間點的測定結果比較；二是使用對血糖幾乎沒有影響的麻醉劑（如氯胺酮，劑量為10mg/kg體重）鎮靜后測試[31]。

另外，猴子等NHP動物的空腹時間也有別于人和其他動物。猴等NHP動物口腔兩側有頰囊結構，攝食時部分食物首先儲存于頰囊中，然后在返回口腔咀嚼消化。因此，在測定猴子等NHP的空腹血糖時，動物禁食時間較人和無頰囊動物長[20]。

我們反復比較了猴的空腹血糖測定，獲得了較為穩定的結果。程序如下：猴禁食（不禁水）13~14 h；用10mg/kg體重氯胺酮肌肉注射麻醉；15~20min后采后肢靜脈血1.5~2.0mL；離心收集血清；在生化儀上測定血糖值。

此外，在測定動物血糖值時，經常用血糖試紙條測定全血。我們在實驗中發現，全血的血糖值通常較血清低0.3~0.7mmol/L。

2、糖耐量試驗：與血糖值相比，糖耐量試驗被認為是糖代謝正常與否的金標準。在人上，糖耐量試驗包括口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）和靜脈注射葡萄糖耐量試驗（intravenous glucose tolerance test，IVGTT）兩種方式。

但對于NHP等動物而言，糖耐量試驗主要采用IVGTT方法，以利于精確控制葡萄糖用量。我們對Bremer等[20]報道的方法進行了改進，即猴禁食13~14 h；肌肉注射麻醉氯胺酮10mg/kg體重；分別在麻醉劑注射后10~15min、20~25min采后肢靜脈血兩次，每次1.5~2.0mL；第二次采血后，同時靜脈注射50%葡萄糖溶液1.2mL/kg體重；分別在葡萄糖注射后5、10、15、30、60、90、120、150min取后肢靜脈血1.5~2.0mL；離心獲得血清，測定血糖值和血清胰島素。計算血清葡萄糖曲線下面積（Area under the curve of glucose tolerance test）、血清胰島素曲線下面積（Area under the curve of blood insulin）、胰島素敏感指數（insulin sensitivity index，ISI）。根據上述指標，可判定種群中不同動物所處的發病時期。

3、其他理化指標：除血糖和糖耐量試驗外，對種群定期監測還包括以下指標：血清胰島素、C反應蛋白、糖化血紅蛋白、血脂（總膽固醇、HDL-C、LDL-C、TG、apoA1、apoB、apoC3等）、脂肪細胞激素（脂聯素、瘦素等）、促炎標志物（CRP、MCP-1、PAI-1等分子）、體重（包括體重指數）、攝食量。雖然這些指標不是糖尿病的核心診斷標志，但可為動物的病程判定和劃分提供有益幫助。

理論上，血清胰島素、C反應蛋白和糖化血紅蛋白對于糖尿病診斷有較高的價值和意義。但我們在猴研究中發現，血清胰島素波動幅度太大，相反C反應蛋白和糖化血紅蛋白又不敏感，不適合作為猴等NHP動物糖尿病的重要標志。

（二）NHP糖尿病模型種群飼養標準

高糖高脂飼料當前廣泛應用于糖尿病模型動物制備，對于猴等NHP動物而言，目前已有商品化的高能量飼料。Bremer等[31]在飼喂商品化高能量飼料的同時，額外給予猴飲用含果糖（75g/天/只）的飲料，最終29只恒河猴飼喂一年后，4只猴發展成為顯性糖尿病（空腹血糖值≥7.0 mmol/L），其余25只都表現代謝綜合癥的某些特征。

我們前期在T2DM遺傳高風險猴的誘導實驗中，根據動物營養需求、食物可口性、飼料堅硬度等指標，最終組成了如下高能量飼料配方：基礎全價飼料55%；牛油25%；蔗糖7.0%；果糖7.0%；膽固醇1.0 %；酪蛋白3.0%；微量元素1.5%；復合維生素0.5%。利用該高能量飼料，動物最早在20 w即出現顯性糖尿病表型（空腹血糖值≥7.0 mmol/L），飼喂32 w，8只T2DM遺傳高風險猴有6只發展成為糖尿病。

而采用食物攝入量限制等措施，不僅延長了糖尿病猴的壽命，而且明顯影響猴糖尿病的進程和并發癥的發生。

這些研究表明，根據實際需求調整猴等NHP模型種群的飼料標準，既可減少動物本身的疾病痛苦，又能保證寶貴資源的最大利用。

（三）NHP糖尿病動物的護理

與人一樣，猴等NHP動物一旦確診為糖尿病，需要對發病動物進行精心護理，防止動物意外死亡，控制糖尿病性腎病、糖尿病性心血管系統疾病、糖尿病性眼病、糖尿病性周圍神經病變等并發癥。

Hansen等根據多年的研究結果，總結了一套糖尿病猴及其并發癥的護理方案。其核心內容包括：（1）當猴首次被確診為糖尿病時，動物體重將逐漸下降，此期如果不需要控制病情發展，動物不需要藥物處理。（2）如果早期需要治療，可給動物口服二甲雙胍等、PPAR激動劑、吡格列酮等降糖；二甲雙胍用量為500~1000mg/天/只，如果動物血糖值仍然處于高位，二甲雙胍可加倍使用；二甲雙胍通常可在一年或數年內能有效控制發病動物體重下降和并發癥產生。（3）對于發病2~3年（也許時間更長）的動物，口服藥物效果不佳，特別是動物出現高血糖（攝食后3~5 h血糖值超過160mg/dL）、體重急劇下降、尿糖和尿蛋白明顯增加等臨床表現時，可給予胰島素治療；最好選用長效胰島素，初始劑量為1~2IU/只，也可根據動物的血糖控制情況，調整胰島素用量。（4）當動物長期疾病而出現低血糖（35mg/dL）表現時，通常可能是因為使用了胰島素，或者動物攝食量明顯減少所致；護理上可通過提高食物和飲料的可口性增加動物攝食，也可通過胃管和靜脈注射等方式補充葡萄糖，直到動物的血糖值達到120mg/dL以上；低血糖猴的治療方案與患者完全相同，如果需要，甚至可給予胰高血糖素。