編者：資源增量是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展的核心任務(wù)，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)生命科學(xué)研究提供支撐和服務(wù)的基礎(chǔ)和保 障。自上世紀(jì) 80 年代以來(lái)，我國(guó)老一輩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)家苦心孤詣，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研發(fā)工作中取得的多項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)新成果。
1988年《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》發(fā)布實(shí)施，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作規(guī)范化、法制化管理，保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，推動(dòng)我國(guó)科技發(fā)展和民生保障等方面發(fā)揮了重要作用。特別是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源標(biāo)準(zhǔn)化、新品種/品 系開(kāi)發(fā)和動(dòng)物模型創(chuàng)制方面，取得了令人矚目的成果。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續(xù)推出我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專家在此領(lǐng)域所作的工作及取得的應(yīng)用成果。
斑馬魚(yú)的科研應(yīng)用和標(biāo)準(zhǔn)化研究
謝訓(xùn)衛(wèi)，潘魯湲，熊鳳，李闊宇，柳力月，張昀，李玲璐，孫永華
中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心，武漢 430072
自上世紀(jì) 90 年代斑馬魚(yú)被引入中國(guó)實(shí)驗(yàn)室以來(lái)，斑馬魚(yú)相關(guān)研究在中國(guó)呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)，現(xiàn)已成為繼美國(guó)之后的全球第二大斑馬魚(yú)研究大國(guó)。國(guó)內(nèi)已經(jīng)有超過(guò) 500 個(gè)以上的研究團(tuán)隊(duì)在以斑馬魚(yú)為工具開(kāi)展科研工 作，涵蓋了生命科學(xué)，健康科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等眾多研究領(lǐng)域。斑馬魚(yú)全基因組測(cè)序自 2011 年啟動(dòng)以來(lái)，已發(fā)布了 11 個(gè)拼接版本，斑馬魚(yú)基因組與人類基因組擁有較高的同源性，可以利用斑馬魚(yú)為工具進(jìn)行人類疾病的 病理學(xué)研究，構(gòu)建疾病模型。中國(guó)目前保存有超過(guò) 13 個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種，斑馬魚(yú)是其中發(fā)展最快的一個(gè)模式生物，它的標(biāo)準(zhǔn)化研究顯得尤為重要。斑馬魚(yú)等水生魚(yú)類目前尚只有地方標(biāo)準(zhǔn)可循，國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心（China Zebrafish Resource Center, 簡(jiǎn)稱CZRC）將有助于斑馬魚(yú)品系資源的標(biāo)準(zhǔn)化，著眼于現(xiàn)有品系資源的整合， 開(kāi)發(fā)新品系和相關(guān)技術(shù)，促進(jìn)資源的優(yōu)化配置和共享服務(wù)。
關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)，標(biāo)準(zhǔn)化研究，國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心，資源，技術(shù)，服務(wù)
1、斑馬魚(yú)的主要生物學(xué)特性
斑馬魚(yú)是一種原產(chǎn)于印度半島和孟加拉國(guó)的熱帶淡水魚(yú)類。在 20 世紀(jì) 70 年代，George Streisinger 首 次利用單體誘變技術(shù)建立純合斑馬魚(yú)品系(Streisinger, 1981)。這一時(shí)期，斑馬魚(yú)主要用于脊椎動(dòng)物的發(fā)育研究。到了 90 年代，分別在德國(guó)和美國(guó)啟動(dòng)的大規(guī)模 ENU 誘變，產(chǎn)生了上千個(gè)對(duì)胚胎早期發(fā)育產(chǎn)生影響的突 變品系，奠定了斑馬魚(yú)作為模式生物的基礎(chǔ)。
斑馬魚(yú)屬于硬骨魚(yú)類，作為一種優(yōu)良的低等脊椎動(dòng)物模式生物，優(yōu)勢(shì)眾多。首先斑馬魚(yú)全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，和人類基因組的相似度超過(guò)87%，71%的人類基因可以在斑馬魚(yú)基因組上找到同源基因，因此可以利用 斑馬魚(yú)為工具進(jìn)行人類疾病的病理學(xué)研究。目前已知的 3000 多個(gè)人類疾病相關(guān)基因有 82%可以在斑馬魚(yú)基因組中有同源基因，可以利用斑馬魚(yú)構(gòu)建各種疾病模型，并以此進(jìn)行藥物篩選(Howe et al., 2013; R, 2013)。
斑馬魚(yú)可以四季產(chǎn)卵，每周可產(chǎn)卵數(shù)百枚，繁殖力非常高，這是其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所無(wú)法比擬的，這也使得以斑馬魚(yú)胚胎為工具開(kāi)展高通量高內(nèi)涵的藥物篩選工作成為一種新趨勢(shì)。
斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育十分迅速，大約 24 小時(shí)就可以完成早期發(fā)育，此外斑馬魚(yú)進(jìn)行體外受精，整個(gè)發(fā)育過(guò)程在體外進(jìn)行，并且其胚胎在早期是透明的，這將有助于我們進(jìn)行活體原位觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。它們的器官具有與人類相同的主要特征，成為研究人類的發(fā)育過(guò)程的優(yōu)良模型。這些特性使斑馬魚(yú)在一些應(yīng)用上明顯優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物的胚胎一般在體內(nèi)發(fā)育，無(wú)法對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤觀察。
斑馬魚(yú)的體型很小，易于養(yǎng)殖，成本相對(duì)較低，它們的養(yǎng)殖模式可以比較容易進(jìn)行復(fù)制，這也是越來(lái)越多的科研工作者使用斑馬魚(yú)進(jìn)行研究工作的重要原因之一。
2、斑馬魚(yú)的科研應(yīng)用
斑馬魚(yú)的優(yōu)勢(shì)出眾，是全球眾多模式生物中發(fā)展最快的，增長(zhǎng)速度甚至趕超小鼠，以斑馬魚(yú)為工具進(jìn)行的研究呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)(Stewart et al., 2014; Xiong et al., 2018)。
斑馬魚(yú)胚胎獲取十分容易，針對(duì)胚胎的基因操作技術(shù)發(fā)展較為成熟，通過(guò)注射DNA，引入外源基因或標(biāo)記基因在體內(nèi)表達(dá)，或采用特異性啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)在胚胎中的組織特異性表達(dá)。日益強(qiáng)大且完善的基因編輯技術(shù)，尤其是 CRISPR/cas9 技術(shù)的出現(xiàn)，使得在斑馬魚(yú)基因組上實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)敲除或編輯成為可能。
中國(guó)引入斑馬魚(yú)研究是在 20 世紀(jì) 90 年代，到了 2000 年，斑馬魚(yú)在國(guó)內(nèi)已被廣泛應(yīng)用于早期胚胎發(fā)育研究，且一度成為斑馬魚(yú)研究增長(zhǎng)的熱點(diǎn)，并逐漸在其他學(xué)科得到推廣。近年來(lái)，斑馬魚(yú)在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用更多地偏重于生化與分子生物學(xué)，毒理學(xué)，環(huán)境科學(xué)和海洋淡水生物學(xué)等學(xué)科。相對(duì)而言，在神經(jīng)科學(xué)，發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)方面的研究群體需要得到進(jìn)一步的壯大(Xie et al., 2015)。
斑馬魚(yú)在科學(xué)界近 40 年的系統(tǒng)研究和應(yīng)用，產(chǎn)生了一大批優(yōu)質(zhì)的品系資源，包括野生品系，突變品系和轉(zhuǎn)基因品系。特異組織細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因品系，被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)和水產(chǎn)育種學(xué)等研究領(lǐng)域。
從 2000 年開(kāi)始，斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因模型在藥物篩選方面逐漸得到了較廣的應(yīng)用，斑馬魚(yú)體型小，產(chǎn)卵量大，其胚胎可以模擬體內(nèi)互作環(huán)境并可直接暴露于包含小分子化合物的溶液中，故可方便地使用96孔板同時(shí)進(jìn)行上千種小分子化合物的藥效篩選。斑馬魚(yú)胚胎在體外發(fā)育，發(fā)育快，早期是透明的，便于對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中表型的改變進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，十分有利于開(kāi)展高通量高內(nèi)涵的藥物篩選。通過(guò)胚胎的死亡率和孵化率的統(tǒng)計(jì)，胚胎發(fā)育過(guò)程中器官大小和形狀的改變監(jiān)測(cè)，心臟缺陷所致心率變化的監(jiān)測(cè)，行為學(xué)檢測(cè)和熒光標(biāo)記檢測(cè)等，來(lái)評(píng)估小分子化合物對(duì)機(jī)體功能的影響。
在血管生成和抗癌藥物篩選的工作中，應(yīng)用得較多的是一些血管特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系，還有一些是特定器官表達(dá)熒光的品系，可以用于跟蹤納米級(jí)藥物遞送系統(tǒng)，或者是測(cè)試藥物對(duì)器官的功效(Kessler et al.,2015)。比較熟知的一個(gè)應(yīng)用典范是 Tg (BMP4:EGFP)轉(zhuǎn)基因品系，其心肌細(xì)胞被綠色熒光標(biāo)記，該品系常被用于心臟毒性藥物的臨床前功能篩選(Lee et al., 2017)。結(jié)合先進(jìn)的成像工具，還可以使用斑馬魚(yú)跳動(dòng)的心臟的假動(dòng)力學(xué) 3D 圖像來(lái)分析藥物遞送后心臟功能的變化(Grunow et al., 2015)。對(duì)于其他的器官模型，這些方法同樣適用。
在組織再生研究方面，科學(xué)家利用斑馬魚(yú)模型獲得了一系列有特色的成果。目前已知的斑馬魚(yú)可以快速修復(fù)的器官有尾鰭，視網(wǎng)膜，肝臟，纖毛細(xì)胞，部分心臟和大腦等。斑馬魚(yú)胚胎的心臟在激光損傷后 24 小時(shí)后可以再生，并恢復(fù)心臟功能，再生能力十分驚人(Matrone et al., 2017)。科學(xué)家利用斑馬魚(yú)組織再生模型進(jìn)行藥物篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥成分丹參酮 IIa (Tanshinone IIa)在不影響中性粒細(xì)胞在損傷部位的聚集的情況下，可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡和反向轉(zhuǎn)移，從而有效減少炎癥的發(fā)生(Robertson et al., 2014)。
早期的自然突變品系的鑒定篩選，大規(guī)模 ENU 誘變，以及近年來(lái)大熱的基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)等，斑馬魚(yú)的突變品系資源日漸豐富。斑馬魚(yú)的基因組與人類基因組擁有較高的相似性，同為脊椎動(dòng)物，發(fā)育模式有較高的相似性，人類疾病相關(guān)基因有82%可以在斑馬魚(yú)基因組上找到同源基因，故可利用斑馬魚(yú)構(gòu)建豐富的人類疾病模型。斑馬魚(yú)的基因組目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 26,000 多個(gè)蛋白編碼基因，這是已測(cè)序脊椎動(dòng)物中數(shù)目最多的(Howeet al., 2013)。大約38%的蛋白編碼基因已經(jīng)通過(guò)各種突變方法和功能研究確定其在斑馬魚(yú)中的作用(Kettleborough et al., 2013)。在斑馬魚(yú)基因組中引入致癌基因或抑癌基因如 P53、APC、PTEN、BRAF 等的人類致病突變，就有可能得到類似癥狀的疾病模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行研究，可為人類疾病的發(fā)生機(jī)理和治療方案帶來(lái)新的曙光。目前的斑馬魚(yú)模型主要可以分為遺傳發(fā)育類疾病模型、癌癥模型、心血管與血液發(fā)生類模型、感染與免疫相關(guān)模型、肌肉與骨骼相關(guān)模型、組織再生類模型和神經(jīng)系統(tǒng)模型等。例如，黑色素瘤是皮膚癌的高致死原因之一，皮膚、粘膜或內(nèi)臟等器官中的黑色素細(xì)胞發(fā)生惡變，最常見(jiàn)的內(nèi)部誘因是癌基因 BRAF 基因的突變所致。在斑馬魚(yú)中引入人類致病突變 BRAF V600E，可引發(fā)黑色素瘤表型，在此模型基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物篩選，來(lái)氟米特(leflunomide)在 2000 多個(gè)藥物中脫穎而出，可以在一定程度上抑制黑色素瘤的發(fā)生(White etal.,2011)。斑馬魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中存在著大量與人類相似的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，多種人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以在斑馬魚(yú)建立對(duì)應(yīng)的疾病模型，如斑馬魚(yú)中的獨(dú)眼針頭表型對(duì)應(yīng)人類的無(wú)腦癥，利用斑馬魚(yú)進(jìn)行研究確定是由CFC1 基因突變?cè)斐傻?Bamford et al., 2000)。
3、斑馬魚(yú)標(biāo)準(zhǔn)化研究國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心建設(shè)
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源是支撐國(guó)家科技創(chuàng)新與發(fā)展的基礎(chǔ)性，公益性的重要戰(zhàn)略生物資源。全球范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源建設(shè)的佼佼者是美國(guó)，美國(guó) NIH 支持建立了國(guó)家級(jí)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源保存和技術(shù)服務(wù)機(jī)構(gòu)，共有36個(gè)中心和資源庫(kù)，保存了 200 多個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種，占全球總物種的 60%。我國(guó)目前僅保存有 13 個(gè)物種的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從20 世紀(jì) 90 年代起，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化被提上日程。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化是資源建設(shè)的重要組成部分，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用的基礎(chǔ)和前提條件，斑馬魚(yú)相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)發(fā)展勢(shì)態(tài)良好，但目前斑馬魚(yú)僅有地方標(biāo)準(zhǔn)可以遵循。
CZRC 于 2012 年在中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所成立，經(jīng)過(guò) 6 年時(shí)間的發(fā)展，成為國(guó)際學(xué)術(shù)界公認(rèn)的全球三 大斑馬魚(yú)資源庫(kù)之一。通過(guò)資源交換、引進(jìn)和自主創(chuàng)建等方式，CZRC 保存的斑馬魚(yú)品系超過(guò) 1400 個(gè)，其中有超過(guò) 200 個(gè)突變和轉(zhuǎn)基因品系是由 CZRC 自主創(chuàng)建。除了品系資源，CZRC 還保藏有 2000 多個(gè) DNA 探針、150個(gè)質(zhì)粒、61 個(gè)斑馬魚(yú)抗體和 2 個(gè)斑馬魚(yú)細(xì)胞系等相關(guān)資源。所有的資源信息均可以在中心網(wǎng)站進(jìn)行查詢 （http://zfish.cn）。CZRC的建立在我國(guó)斑馬魚(yú)學(xué)界中架構(gòu)起良性溝通的渠道，有力地促進(jìn)斑馬魚(yú)品系資源的標(biāo)準(zhǔn)化，促進(jìn)資源的優(yōu)化配置和共享服務(wù)，為國(guó)家科技創(chuàng)新與發(fā)展提供優(yōu)質(zhì)的資源和技術(shù)服務(wù)。我國(guó)的斑馬 魚(yú)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化將主要從存量?jī)?yōu)化，增量建設(shè)和共享服務(wù)這三個(gè)方面著手，旨在促進(jìn)斑馬魚(yú)在我國(guó)研究與應(yīng)用領(lǐng)域的進(jìn)一步普及，和應(yīng)用的規(guī)范化。
3.1 存量?jī)?yōu)化
國(guó)內(nèi)的斑馬魚(yú)研究正在高速發(fā)展階段，研究體量在逐年增加，由本世紀(jì)初的不足 2%迅速發(fā)展到 2017 年的23%，成為繼美國(guó)之后的第二大斑馬魚(yú)研究大國(guó)(Xie et al., 2015)。一方面，大量具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品系和新資源在中國(guó)斑馬魚(yú)學(xué)界不斷產(chǎn)出，另一方面，科研工作者對(duì)相關(guān)研究資源、技術(shù)服務(wù)方面的需求也在不斷擴(kuò)大。斑馬魚(yú)品系的安全保藏和便利分享，必然即是領(lǐng)域內(nèi)研究者的迫切需求，CZRC作為中國(guó)唯一的國(guó)家級(jí)斑馬魚(yú)資源平臺(tái)，自然承擔(dān)起雙方面的工作，承接起中國(guó)斑馬魚(yú)學(xué)界溝通橋梁的重任。此外放眼全球，在國(guó)際斑馬魚(yú)研究領(lǐng)域，相關(guān)研究起步早，尤其是上世紀(jì) 90 年代在斑馬魚(yú)中啟動(dòng)的大規(guī)模誘變篩選工作，研究人員已構(gòu)建了數(shù)萬(wàn)種遺傳突變和轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系，這些品系大部分都保存在美國(guó)的國(guó)際斑馬魚(yú)資源中心和德國(guó)的歐洲斑馬魚(yú)資源中心。這其中包含有眾多的重要的動(dòng)物模型，但是目前活體動(dòng)物進(jìn)出口程序十分復(fù)雜，獲取知識(shí)產(chǎn)權(quán)授權(quán)困難重重，故大多數(shù)品系都不能為國(guó)內(nèi)研究者所用。CZRC致力于為國(guó)內(nèi)研究者提供優(yōu)良斑馬魚(yú)相關(guān)資源，目前已經(jīng)和 ZIRC 建立正式合作，將有計(jì)劃地從 ZIRC 批量引進(jìn)斑馬魚(yú)品系(Xiong et al., 2018)。
經(jīng)過(guò)半個(gè)世紀(jì)的研究與發(fā)展，斑馬魚(yú)的生物學(xué)特性，如種群動(dòng)態(tài)特征，遺傳檢測(cè)，種群性別比例變化規(guī)律，生長(zhǎng)模式，生理生化指標(biāo)，繁殖啟動(dòng)時(shí)間，腸道寄生生物指標(biāo)等已陸續(xù)測(cè)定。2015年，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所、中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所（國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心）等單位開(kāi)展合作，研制斑馬魚(yú)遺傳、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境、病原等質(zhì)量控制的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。斑馬魚(yú)研究在我國(guó)日漸普及，制訂其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義，接下來(lái)我們將對(duì)斑馬魚(yú)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容進(jìn)行簡(jiǎn)要的介紹。
3.1.1 遺傳質(zhì)量控制
斑馬魚(yú)采取的是體外受精、體外發(fā)育的發(fā)育模式，繁殖用種魚(yú)必須遺傳背景明確，來(lái)源清楚，有較完整的資料（包括品系名稱、傳代代數(shù)、遺傳基因特點(diǎn)及主要生物學(xué)特征等）。
在 CZRC，野生型斑馬魚(yú)品系采用封閉群的傳代方式，至少使用 25 對(duì)及以上的親本種魚(yú)，這樣可以保證了生物特性的多樣性，保持封閉群動(dòng)物的遺傳基因的穩(wěn)定，避免近親交配常出現(xiàn)的種質(zhì)退化現(xiàn)象。對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)室，建議引種種魚(yú)數(shù)不得少于 25 對(duì)，種魚(yú)應(yīng)來(lái)自于基礎(chǔ)封閉群。
CZRC 也曾針對(duì)兩種常用的斑馬魚(yú)野生品系，AB 和 TU，篩選并選取了 20 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，應(yīng)用部分篩選的微衛(wèi)星位點(diǎn)成功地對(duì)這兩種品系進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。
3.1.2 病原學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)
針對(duì)斑馬魚(yú)的病原監(jiān)測(cè)不僅要監(jiān)測(cè)和消除養(yǎng)殖設(shè)備和水環(huán)境的潛在病原體，還有外來(lái)品系的隔離檢疫管理。監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)主要有品系魚(yú)的來(lái)源，水環(huán)境的指標(biāo)，飼養(yǎng)管理規(guī)范，實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，斑馬魚(yú)日常觀察等。對(duì)于已存在或潛在的魚(yú)病，應(yīng)及時(shí)處理，分離異常表現(xiàn)斑馬魚(yú)，隔離觀察、改善水環(huán)境指標(biāo)，詳細(xì)記錄異常情況及其變化情況。不管是非感染性或感染性疾病，均會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)的健康造成危害，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是感染性疾病，常常可形成大面積的爆發(fā)性感染，需要嚴(yán)加防范。
按照病原，斑馬魚(yú)的主要感染性疾病可以分為病毒性疾病，細(xì)菌性疾病，真菌和藻類引起的疾病和原生動(dòng)物引起的疾病。斑馬魚(yú)魚(yú)病應(yīng)以預(yù)防為主，關(guān)鍵在于日常標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化的飼養(yǎng)管理和實(shí)驗(yàn)操作(Liu et al.,2016)。對(duì)于引進(jìn)的外來(lái)品系，采取隔離檢疫和消毒措施，引進(jìn)的活體先進(jìn)行健康檢查，隔離飼養(yǎng)期間（一般為2 周）相關(guān)檢查結(jié)果為陰性的品系，可進(jìn)行傳代并將胚胎消毒后轉(zhuǎn)移至主養(yǎng)殖系統(tǒng)中，用于生產(chǎn)和相關(guān)研究，盡量減少其攜帶和傳播病原的風(fēng)險(xiǎn)。
日常管理中，應(yīng)制定良好的飼養(yǎng)操作與日常管理規(guī)范，減少魚(yú)病的發(fā)生，保證培育工作的順利進(jìn)行，杜絕種質(zhì)污染。排除常見(jiàn)的人類共患病病原，以保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和實(shí)驗(yàn)人員的健康與安全。排除對(duì)魚(yú)類危害大的病原，以保障斑馬魚(yú)培育工作和實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行。排除對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具潛在干擾的主要病原如支原體等，以確保動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
3.1.3 飼料
不同發(fā)育時(shí)期的幼魚(yú)或成魚(yú)應(yīng)根據(jù)其自身特點(diǎn)選擇合適口徑的活體或顆粒餌料進(jìn)行投喂。幼魚(yú)早期的喂養(yǎng)與管理方式對(duì)成活率有重大影響。剛孵出的幼魚(yú)口裂小，喜好攝食活餌，開(kāi)口餌料一般可選用草履蟲(chóng)、輪蟲(chóng)、人工飼料等小口徑餌料。人工飼料不便于水質(zhì)管理，輪蟲(chóng)等活餌容易寄生病原體，故最常用的是草履蟲(chóng)。
半月齡左右的幼魚(yú)可以開(kāi)始攝食鹵蟲(chóng)幼蟲(chóng)或大口徑顆粒飼料。活體餌料與顆粒餌料相比，由于幼魚(yú)的視覺(jué)系統(tǒng)與消化系統(tǒng)逐步發(fā)育的緣故，前者營(yíng)養(yǎng)全面，適口性高，可大幅提高幼魚(yú)的存活率，如果能同時(shí)輔以顆粒飼料，補(bǔ)充蛋白質(zhì)、脂肪、糖、無(wú)機(jī)鹽和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以進(jìn)一步提高幼魚(yú)的存活率。
3.1.4 環(huán)境條件
環(huán)境條件最重要的內(nèi)容之一就是養(yǎng)殖水環(huán)境的水質(zhì)控制，水質(zhì)因素主要有水溫、溶解氧、非離子氨、亞硝酸態(tài)氮、pH、硬度等，其中水溫、溶解氧、氨氮值等與養(yǎng)殖過(guò)程管理關(guān)系較大。斑馬魚(yú)的最適生長(zhǎng)溫度是 28.5℃，在20℃～28℃溫度區(qū)間可以正常生長(zhǎng)，溫度過(guò)低或過(guò)高都容易生病或出現(xiàn)死亡。溶解氧是魚(yú)類賴以生存的必要條件，直接影響呼吸，間接影響魚(yú)類的攝食和消化活動(dòng)而影響生長(zhǎng)發(fā)育。通過(guò)空氣壓縮機(jī)使空氣中的氧氣溶解于水中或采取循環(huán)水體來(lái)增加溶氧量，都可以在一定程度上加速了水中有機(jī)物質(zhì)的分解，有利于水質(zhì)改善。氨氮主要來(lái)源于魚(yú)類的排泄物和食物殘?jiān)群袡C(jī)物的分解作用，對(duì)魚(yú)類有害，可對(duì)其鰓部表皮細(xì)胞造成損害，嚴(yán)重的會(huì)使其喪失免疫力，引發(fā)感染。養(yǎng)殖水體需要及時(shí)排污，可有效降低氨氮值。水質(zhì)控制最重要的就是做好循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的日常管理。
其次是設(shè)施環(huán)境，循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的材質(zhì)和設(shè)備陳設(shè)安排等都應(yīng)按斑馬魚(yú)的體型和生活習(xí)性而盡量?jī)?yōu)化。設(shè)施所處空間要求光線充足，通風(fēng)良好，排污排水設(shè)施齊全，配備照明設(shè)備和加溫系統(tǒng)，配備增氧和過(guò)濾系統(tǒng)。主要的水質(zhì)參數(shù)應(yīng)配備相應(yīng)的探頭進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，強(qiáng)大而有效率的配套設(shè)施是水質(zhì)穩(wěn)定的重要支持。 CZRC在綜合考慮所有因素，參考了國(guó)際和國(guó)內(nèi)的斑馬魚(yú)研究同行的平臺(tái)，建立了安全規(guī)范的斑馬魚(yú)養(yǎng)殖和健康平臺(tái)，并在此基礎(chǔ)上，建立了高效的基因操作平臺(tái)和穩(wěn)定高效的精子凍存平臺(tái)。CZRC 占地600平米，由一流標(biāo)準(zhǔn)的斑馬魚(yú)資源保藏區(qū)和遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室組成。其中，資源保藏區(qū)包括主魚(yú)房、外來(lái)魚(yú)隔離房、育苗室、顯微注射室和精子超低溫保藏室等功能區(qū)域。主養(yǎng)魚(yú)房面積為 350 平米，最大養(yǎng)殖容量超過(guò) 20 萬(wàn)尾成年斑馬魚(yú)(Li KY, 2014)。在已保存的1400多種斑馬魚(yú)品系中，有約400種以活體形式養(yǎng)殖在魚(yú)房?jī)?nèi)，有1200多種已通過(guò)超低溫精子凍存的方式進(jìn)行保藏。2015 年著手建立斑馬魚(yú)精子凍存庫(kù)系統(tǒng)，配備有 2 個(gè)大型液氮儲(chǔ)藏罐，可容納 5 萬(wàn)管以上的精子凍存樣本，現(xiàn)有凍存精子樣品超過(guò)10000管，平均復(fù)蘇受精率54%，最好的紀(jì)錄超過(guò)90%，精子樣品復(fù)蘇受精率達(dá)到全球最佳水平。
CZRC 的斑馬魚(yú)品系資源主要來(lái)源依次為收集整理國(guó)內(nèi)學(xué)者創(chuàng)制的斑馬魚(yú)品系，CZRC 自主創(chuàng)制斑馬魚(yú)品系，以及由海外實(shí)驗(yàn)室和資源中心引進(jìn)。這三種來(lái)源的斑馬魚(yú)品系占全部保藏資源的比例依次為 55%，30%和 15%，整體上超過(guò)80%的品系資源是由中國(guó)的斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立創(chuàng)制后提交保藏，擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，在全球范圍內(nèi)為 CZRC 所獨(dú)有。2018 年，我國(guó)斑馬魚(yú)研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)室已超過(guò) 500 家，為了有效收集這些實(shí)驗(yàn)室自主創(chuàng)制的斑馬魚(yú)相關(guān)資源，CZRC每年都會(huì)對(duì)集中調(diào)研中國(guó)斑馬魚(yú)學(xué)界的論文發(fā)表情況，收集已發(fā)表論文的斑馬魚(yú)相關(guān)新資源的信息，力求爭(zhēng)取整合這些新資源到 CZRC，并在斑馬魚(yú)研究領(lǐng)域共享。
3.2 增量建設(shè)
在斑馬魚(yú)品系資源增量建設(shè)的道路上，我們要重視掌握和研究最新的斑馬魚(yú)品系開(kāi)發(fā)技術(shù)，積極創(chuàng)制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品系資源，尤其是可以作為疾病模型和研究新工具的基因突變品系和轉(zhuǎn)基因品系。 在國(guó)際上，最大規(guī)模的斑馬魚(yú)品系和基因資源集中儲(chǔ)備在位于美國(guó)俄勒岡大學(xué)的國(guó)際斑馬魚(yú)資源中心（Zebrafish International Resource Center，簡(jiǎn)稱 ZIRC），由于接管了歐美數(shù)家研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行的大規(guī)模基因組誘變項(xiàng)目的成果，其保藏斑馬魚(yú)品系數(shù)量已超過(guò) 3 萬(wàn)種。與之相類似，位于德國(guó)的歐洲斑馬魚(yú)資源中心（European Zebrafish Resource Center，簡(jiǎn)稱 EZRC）也已保藏各類斑馬魚(yú)品系 2 萬(wàn)多種。CZRC 保藏的斑馬魚(yú)品系資源在短短 6 年時(shí)間里從 200 多種增加到 1400 多種也主要得益于 2013 年啟動(dòng)的斑馬魚(yú) 1 號(hào)染色體全基因敲除計(jì)劃（簡(jiǎn)稱 ZKO 計(jì)劃）。ZKO 計(jì)劃由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、北京大學(xué)和清華大學(xué)等單位的 38 家實(shí)驗(yàn)室共同參與，歷時(shí)近 3 年，本項(xiàng)目共計(jì)構(gòu)建特異性的斑馬魚(yú)突變品系 714 個(gè)，全部品系信息都在 CZRC 網(wǎng)站和國(guó)際斑馬魚(yú)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)。項(xiàng)目產(chǎn)生品系全部保藏在 CZRC 斑馬魚(yú)精子凍存庫(kù)中，并對(duì)國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界公開(kāi)(http://www.zfish. cn/TargetList.aspx)。這是我國(guó)斑馬魚(yú)學(xué)界第一次進(jìn)行大規(guī)模的系統(tǒng)誘變篩選，項(xiàng)目的進(jìn)展和成果已取得了全球性的關(guān)注和影響力。
CZRC 在發(fā)展初期建立了基于 TALEN 技術(shù)的基因敲除平臺(tái)和基于CRISPR/Cas9 技術(shù)的基因敲除平臺(tái)，以及基于Tol2的轉(zhuǎn)基因操作平臺(tái)。隨后結(jié)合斑馬魚(yú)原始生殖細(xì)胞操作技術(shù)，分別建立了高效、特異的斑馬魚(yú)原始生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)基因操作平臺(tái)和基于CRISPR/Cas9技術(shù)的斑馬魚(yú)原始生殖細(xì)胞基因敲除平臺(tái)。這兩個(gè)平臺(tái)中，外源DNA 或 mRNA 偏好作用于生殖細(xì)胞，整合外源基因或被打靶編輯，故可相對(duì)更快速地篩選出具有可遺傳性狀的子代。截止目前，CZRC 利用基因組編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功地自主創(chuàng)制了超過(guò) 200 個(gè)基因突變品系和轉(zhuǎn)基因品系。CZRC 將持續(xù)為各個(gè)領(lǐng)域的研究者提供特異性品系構(gòu)建服務(wù)，在未來(lái) 2 年，CZRC將進(jìn)一步創(chuàng)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人類疾病模型，并建設(shè)高通量斑馬魚(yú)藥物篩選平臺(tái)。建成后，該平臺(tái)將可服務(wù)于環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥物藥效評(píng)估、新藥篩選和各種斑馬魚(yú)行為學(xué)研究的科研和應(yīng)用領(lǐng)域。
3.3 共享服務(wù)
斑馬魚(yú)品系資源的持續(xù)擴(kuò)容優(yōu)化和便于分享，將極大地促進(jìn)中國(guó)斑馬魚(yú)研究的深化發(fā)展，CZRC在中國(guó)斑馬魚(yú)學(xué)界負(fù)責(zé)起品系收集和共享，信息溝通的重任。相比于美國(guó)的 ZIRC 和歐洲的 EZRC 兩大斑馬魚(yú)資源平臺(tái)，CZRC具有特殊的技術(shù)服務(wù)優(yōu)勢(shì)，除了為國(guó)內(nèi)外用戶提供標(biāo)準(zhǔn)的斑馬魚(yú)品系資源，還可以為斑馬魚(yú)研究者提供 品系構(gòu)建、技術(shù)培訓(xùn)、信息共享、科研及技術(shù)咨詢等方面的服務(wù)，促進(jìn)了斑馬魚(yú)相關(guān)養(yǎng)殖和研究新技術(shù)等在國(guó)內(nèi)斑馬魚(yú)學(xué)界的信息共享。
CZRC 自成立以來(lái)為全國(guó)29個(gè)省區(qū)市180多家機(jī)構(gòu)提供各類斑馬魚(yú)相關(guān)資源服務(wù)800多批次。此外，為日本、韓國(guó)、美國(guó)、德國(guó)和瑞士等國(guó)家的16家機(jī)構(gòu)提供資源26批次。提供的品系要求符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，遺傳背景清晰，資料信息齊全。品系資源運(yùn)輸也是嚴(yán)格遵照活體運(yùn)輸規(guī)范執(zhí)行，保證容器的安全，保持水溫的 相對(duì)恒定，控制容器的氧氣含量，選擇最快捷的運(yùn)輸方式，以確保活體品系的健康安全送達(dá)。CZRC的服務(wù)獲得了國(guó)內(nèi)外研究同行的高度認(rèn)可，截至目前，由 CZRC 提供品系資源所發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)累計(jì)已超過(guò) 140 篇。
CZRC提供的技術(shù)服務(wù)主要包括構(gòu)建特異性轉(zhuǎn)基因及基因敲除品系、舉辦全國(guó)性斑馬魚(yú)技術(shù)培訓(xùn)班、斑馬魚(yú)養(yǎng)殖技術(shù)咨詢、斑馬魚(yú)魚(yú)病咨詢等。2013 年以來(lái)總共提供品系構(gòu)建服務(wù) 40 余次，構(gòu)建了 70多個(gè)特異性轉(zhuǎn)基因或基因突變品系，為一線科研課題提供了有力的技術(shù)支撐。技術(shù)培訓(xùn)班采用采用理論課與實(shí)驗(yàn)課相結(jié)合的 方式，現(xiàn)已舉辦 8 期，參訓(xùn)學(xué)員 200 多人次，培訓(xùn)專題包括斑馬魚(yú)魚(yú)房建設(shè)和健康養(yǎng)殖、原位雜交、顯微注射、精子凍存和基因組編輯技術(shù)等斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。CZRC從建立開(kāi)始即努力為斑馬魚(yú)相關(guān)科研人員提供斑馬 魚(yú)養(yǎng)殖健康和魚(yú)病等咨詢服務(wù)，介紹科學(xué)的養(yǎng)殖參數(shù)和養(yǎng)殖要點(diǎn)，及常見(jiàn)魚(yú)病預(yù)防和處理措施等。CZRC希望通過(guò)這種咨詢服務(wù)可以在一定程度上提高魚(yú)房管理人員的科學(xué)養(yǎng)殖技術(shù)水平，加強(qiáng)國(guó)內(nèi)斑馬魚(yú)魚(yú)房的健康發(fā)展。
除此之外，CZRC在學(xué)術(shù)服務(wù)方面也做了很多努力。每?jī)赡昱e辦“中國(guó)斑馬魚(yú) PI 大會(huì)”，成為領(lǐng)域內(nèi)資深科學(xué)家交流的重要平臺(tái)。2016 年 9 月，CZRC參與籌建的中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)斑馬魚(yú)分會(huì)正式成立, 學(xué)會(huì)將依據(jù)斑馬 魚(yú)的學(xué)科特點(diǎn)和國(guó)際發(fā)展趨勢(shì)，開(kāi)展相關(guān)工作。從 2017 年開(kāi)始建設(shè)“中國(guó)斑馬魚(yú)信息中心”平臺(tái)（www.zfin.cn）。
該平臺(tái)將涵蓋中國(guó)斑馬魚(yú)學(xué)會(huì)網(wǎng)站、學(xué)界信息人員交流平臺(tái)、斑馬魚(yú)品系資源管理和資源共享等方面的功能。 CZRC力求能為中國(guó)斑馬魚(yú)研究領(lǐng)域各類資源信息保藏、交流和共享提供有力的支持。
CZRC將利用自身優(yōu)勢(shì)，持續(xù)擴(kuò)大斑馬魚(yú)相關(guān)資源的收集、保藏和分享規(guī)模。首先 CZRC 擁有全球最佳水平的斑馬魚(yú)精子凍存保藏系統(tǒng)，可利用此系統(tǒng)為全國(guó)的斑馬魚(yú)學(xué)界提供品系凍存支持并同時(shí)收集我國(guó)研究者創(chuàng)制 的品系資源。其次，CZRC有全國(guó)最豐富的斑馬魚(yú)基因編輯及轉(zhuǎn)基因技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，不僅可為各個(gè)領(lǐng)域的研究者提 供特異性品系構(gòu)建服務(wù)，還將持續(xù)自主創(chuàng)制服務(wù)于最新科研方向的各類斑馬魚(yú)品系及模型。第三，CZRC正在 建設(shè)的“中國(guó)斑馬魚(yú)信息中心”系統(tǒng)，將不僅實(shí)現(xiàn)更便捷的網(wǎng)上資源服務(wù)流程，同時(shí)還將為中國(guó)的斑馬魚(yú)學(xué)界 提供學(xué)科內(nèi)資訊、人員情況、科研交流及斑馬魚(yú)品系管理方面的網(wǎng)絡(luò)共享服務(wù)。
17312606166