大动物实验-动物试验中心-临床前研究「江苏美凤力医疗科技有限公司」

編者：資源增量是實驗動物科技發展的核心任務，是實驗動物對生命科學研究提供支撐和服務的基礎和保障。自上世紀80年代以來，我國老一輩實驗動物科學家苦心孤詣，在實驗動物資源研發工作中取得的多項開創新成果。

1988年《實驗動物管理條例》發布實施，在實驗動物工作規范化、法制化管理，保障實驗動物和動物實驗的質量，推動我國科技發展和民生保障等方面發揮了重要作用。特別是在實驗動物資源標準化、新品種/品系開發和動物模型創制方面，取得了令人矚目的成果。

為此，借“科技資訊”之窗，陸續推出我國實驗動物專家在此領域所作的工作及取得的應用成果。

無菌豬培育的標準化研究與應用展望

孫靜， 劉作華，葛良鵬

（1．重慶市畜牧科學院，重慶402460）（2.農業部養豬科學重點實驗室，重慶402460）

（3.重慶市養豬科學重點實驗室，重慶402460）（4.醫用動物資源開發與利用技術工程中心，重慶402460）

無菌豬是通過對符合標準的供體母豬進行無菌剖腹產，獲得無菌仔豬，并將其飼養在無菌隔離器內，呼吸無菌的空氣，食用無菌的飲水和食物，培育出的利用現有技術不能檢測出任何活的微生物的一種特殊模式動物［1］。由于其微生物背景清晰，是研究菌群相關疾病不可多得的實驗動物。同時，其嚴格的微生物控制也為豬源性生物醫藥產品的開發提供了生物安全保障。

無菌豬培育的標準化研究，旨在實現無菌豬資源的標準化、規范化應用轉化與可持續發展，保證批量化供應合格的無菌豬資源，保障無菌豬相關研究結果準確性、重復性和可靠性。本文結合課題組在無菌豬培育方面的多年工作積累，就無菌豬培育的標準化研究，包括環境、營養、微生物等標準化控制進行探討，并就無菌豬在畜牧、食品、生物醫藥等領域的應用進行展望。

1無菌豬培育標準化研究

1.1環境條件標準化研究

環境條件標準化是無菌豬標準化培育的基礎，主要包括無菌豬培育的屏障環境設施和無菌豬生產專用設備標準化。

1.1.1無菌豬培育的屏障環境設施

無菌豬培育的環境屏障設施須遵照《實驗動物設施建筑技術規范》（GB 50447-2008），《潔凈室及相關受控環境國際標準》（ISO 14644）以及《實驗動物 環境及設施》（GB 14925- 2010）進行修建。要求環境潔凈度達到7級、溫度維持在20℃-26℃、空氣濕度維持在40%-70%之間。

1.1.2無菌豬生產專用設備的標準化

經過多年的實踐和摸索，重慶市畜牧科學院自主設計并委托成都達碩實驗動物公司制作了無菌豬培育的關鍵設備，包括豬用無菌子宮剝離器、無菌豬運輸隔離器和無菌豬飼養隔離器，并制定了《無菌豬 飼養隔離器》（Q-BSD 4-2016），《無菌豬 子宮剝離器》（Q-BSD 5-2016）和《無菌豬 無菌運輸器》（Q-BSD 6-2016）三個企業標準，以保證無菌豬從獲取、運輸、飼養過程始終處于無菌環境。目前，此三個標準已完成重慶市地方標準和實驗動物團體標準立項。

1.2無菌豬營養標準化研究

商業化乳豬奶粉經Co60輻照并微生物檢測合格后均可飼喂無菌仔豬。斷奶階段（≥21日齡后），可逐漸換為滅菌的粉狀飼料，濕拌料更利于仔豬的采食，減少浪費。本平臺制定了Q-BSD 2-2016《無菌豬 代乳料》企業標準，規定了其衛生要求、檢驗規則、包裝、貯存和保質期等技術要求。

1.3無菌豬微生物質量標準研究

無菌豬的微生物質量控制包括供體母豬的質量控制和無菌仔豬質量控制兩部分。

1.3.1供體母豬的微生物質量標準

供體豬要求臨床上排除經胎盤垂直傳播的四種疾病，包括豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合癥、豬偽狂犬病和豬細小病病毒[2]。

1.3.2無菌豬的微生物質量控制標準

由于我國暫未頒布無菌豬微生物檢測標準。本平臺也建立了一套無菌豬樣品采集與送檢的標準操作SOP，包括動物樣品采集與送檢的標準操作規程、隔離器內環境樣品的采集與送檢的標準操作規程、動物和環境樣本的微生物檢測標準操作規程；同時，建立了一套無菌豬微生物學監測的企業標準（Q-BSD 3-2016）。

1.4無菌豬培育標準操作SOP的建立

為最大限度地避免因人為操作不規范，造成屏障設施或隔離器運行不正常和無菌豬污染事件的發生，建立一套行之有效的屏障設施運行管理與標準操作規范，才能確保無菌豬的應用需求。

參考《SPF豬病原的控制與監測》（GBT 22914-2008）、《實驗動物 微生物學等級及監測》（GB 14922.2-2011）、《實驗動物 寄生蟲等級檢測》（GB 14922.1-2011）和《實驗動物 無菌動物生活環境及糞便標本的檢測方法》（GBT 14926.41-2001）等無菌動物質量管理國家標準，結合無菌豬自身的特性和培養過程的實際情況。本實驗室建立了一套無菌豬生產管理和標準操作SOP，包括屏障環境獲取與維持的標準操作規程、隔離器清潔與滅菌操作規程、物品滅菌的標準操作規程、空氣過濾模塊更換操作規程、動物清潔與消毒的標準操作規程、動物進出手術室的標準操作規程、動物麻醉藥的標準使用規程、子宮剖除術的標準操作規程、無菌新生仔豬發生異常時的標準操作規程、死亡動物尸體處置的標準操作規程、處置實驗動物和異常死亡動物的標準操作規程、動物樣品采集與送檢的標準操作規程、隔離器內環境樣品的采集與送檢的標準操作規程、動物和環境樣本的微生物檢測標準操作規程等。以達到標準化生產的目的。

SOP的實施須“以人為本”，要求飼養管理人員和檢驗技術人員應嚴格遵守，未經有關SOP培訓的不能上崗。

2無菌豬的應用展望

2.1畜牧生產領域

早期無菌豬培育的目的主要是為了進行種豬的疫病凈化，隨著豬克隆技術的不斷成熟，利用克隆和無菌豬培育相結合是進行種豬疫病凈化的有效途徑。一些種豬生產性能優異，但由于各種原因感染某些疾病，不宜繼續作為種用，則可以通過從種豬上分離細胞，經檢測細胞無特定感染后，即可通過克隆和無菌凈化的方法重新克隆獲得種豬，延長其種用價值。

無菌豬和普通豬的比較研究發現，兩者在腸道小腸絨毛結構和免疫系統發育方面存在較大的差異[3，4]，提示菌群對豬的營養吸收和抗病力影響較大。因此，利用無菌豬模型，開展豬的營養代謝和抗病力研究，研發新型飼料或添加劑，降低養豬生產中的獸藥用量，是一個非常重要的研究方向。此外，由于未受任何病原微生物感染，無菌豬的血清也是相關疾病診斷試劑盒的優質陰性血清。

2.2特殊膳食產品的開發

腸道菌群和營養物質吸收和免疫系統發育密切相關，同時，豬的腸道結構、消化生理、代謝特性等與人類相似性較大。因此，將無菌豬接種不同類型人群的腸道菌群，模擬其消化代謝特點，可針對性的開發適于不同人群的特殊膳食產品。

例如，可將嬰幼兒的腸道菌群接種到無菌豬的體內，模擬其消化吸收特點和免疫系統的發育，開展兒童疫苗、嬰幼兒奶粉的質量評價，或開展嬰幼兒食物過敏相關研究，開發特殊嬰幼兒食品。此外，腫瘤放化療患者腸道菌群受放化療影響較大，可將其移植至無菌豬體內，特異性開發適宜腫瘤放化療患者消化吸收的特殊食品，改善其抵抗力，幫助疾病的恢復。同樣的原理，可針對不同腸道菌群相關的疾病，特異性的利用無菌豬建立其對應的腸道菌群模型，研究其消化吸收特性，對應的開發一類特殊膳食產品，通過飲食調理協助病人康復。

2.3生物醫藥領域的應用

越來越多的研究表明，腸道菌群與高血壓、糖尿病、自身免疫疾病、以及抑郁等疾病均有相關性。而將菌群與疾病的相關性研究推進到因果性研究水平，無菌豬是一個非常適宜的動物模型。與常用的嚙齒類實驗動物相比，豬在生理和遺傳上與人類更為相似[5，6]，由于其背景微生物清晰，可清晰的闡述移植的菌群與表型的因果關系，特別是將無菌豬與基因編輯豬相結合，可進一步闡明菌群－基因－宿主三者之間的作用，為腸道菌群為靶點的疾病診療新技術、新產品的開發和評價提供實驗動物支撐。利用無菌動物技術“轉入”（菌群移植）和“敲除”（動物無菌化）特定菌群，有助于解析眾多疾病（如兒童自閉癥、自身免疫疾病和炎癥性腸病等）的發病機理或菌群對疾病的影響。比如，由于剖腹產手術獲取的無菌仔豬未接觸母源抗體和免疫細胞，這樣的免疫功能不全的豬模型顯然是一種合適的動物模型，可幫助理解和調查早產兒的健康狀況[7]；或建立菌群、營養和治療干預手段，達到改善其器官或免疫系統等發育。

利用無菌豬進行人體細胞／組織／器官的培養，將是未來人體器官私人定制的重要發展方向。通過基因編輯技術，可阻斷豬特定器官的發育，將人自體干細胞植入器官發育阻斷的豬的胚胎或胎兒體內，有望利用人干細胞實現器官發育補償，在動物體內生長出人類的細胞／組織／器官，實現人體器官的私人定制。在此研究過程中，利用無菌豬一方面可保障豬源性產品的生物安全性，另一方面，在某些研究階段，需要將人類細胞植入免疫缺陷豬的體內以避免免疫排斥，而免疫缺陷豬[8]只有在無菌狀態才能健康生長。