大动物实验-动物试验中心-临床前研究「江苏美凤力医疗科技有限公司」

生殖顆粒是特異性存在于動物生殖細胞的細胞質中的無膜細胞器（MLOs），參與多種RNA相關的代謝過程，包括小RNA加工、mRNA儲存、mRNA翻譯和降解等。在哺乳動物雄性生殖細胞中存在著一類位于線粒體簇之間的生殖顆粒，被稱為intermitochondrial cement（IMC）。piRNA是一種在生殖細胞中特異性表達的小非編碼RNA，與 PIWI蛋白結合形成復合物通過抑制轉座子、調節基因表達等機制促進精子發生的正常進行。IMC的組分中包含大量與piRNA生成有關的蛋白，因此IMC被認為是piRNA加工的主要場所。哺乳動物生殖細胞中IMC的形成對于piRNA生成以及精子發生至關重要，然而目前對于IMC的形成機制一直未知。研究表明，相分離（phase separation）通過生物大分子（包括蛋白質、RNA、DNA等）之間的多價相互作用形成大分子凝聚物，在細胞中促進多種無膜細胞器的形成。在果蠅、線蟲以及斑馬魚的生殖細胞中，相分離參與多種生殖顆粒的組裝。但是，相分離是否參與哺乳動物生殖顆粒的組裝還不清楚。

2024年7月18日，同濟大學生命科學與技術學院丁德強教授團隊在Developmental Cell上在線發表題為TDRD1 phase separation drives intermitochondrial cement assembly to promote piRNA biogenesis and fertility的文章。該研究揭示了TDRD1蛋白通過相分離活性驅動IMC組裝的分子機制，并證明相分離驅動的IMC組裝對于piRNA的生成、轉座子沉默以及雄性生殖細胞發育至關重要。

已知TDRD1蛋白定位于雄性生殖細胞的IMC中，TDRD1缺失導致piRNA生成缺陷以及精子發生停滯【5】。為了研究TDRD1蛋白的分子功能，研究人員首先借助熒光漂白恢復實驗、細胞內融合與分離實驗以及體外純化蛋白的相分離實驗證明TDRD1蛋白在細胞內和體外具有相分離活性。進一步研究發現TDRD1通過位于C端的coiled-coil超螺旋結構域自我相互作用，并自組裝成四聚體來驅動相分離活性。

通過一系列突變質粒的篩選，研究人員鑒定出coiled-coil結構域中的疏水氨基酸基序（1149ILLFLL1154）對于TDRD1的自我相互作用以及相分離活性至關重要。將疏水氨基酸基序突變后，TDRD1無法自我相互作用，從而失去相分離活性。除此之外，TDDR1蛋白包含4個串聯的Tudor結構域。研究人員發現Tudor結構域通過識別對稱精氨酸二甲基化修飾（sDMA）的蛋白，來促進TDRD1發生相分離。因此，TDRD1通過coiled-coil結構域的自組裝以及Tudor-sDMA相互作用來獲得多價相互作用，協同促進TDRD1相分離活性。

為了研究TDRD1相分離活性在生殖細胞中的生理功能，研究人員制作了TDRD1相分離活性缺失突變小鼠。研究人員將TDRD1蛋白C端coil-coil結構域中的疏水氨基酸基序ILLFLL突變成GSGSGS，使得TDRD1蛋白在生殖細胞中失去相分離活性。TDRD1相分離活性缺失突變小鼠雄性不育，其精子發生停滯在減數分離前期，無法產生成熟精子。進一步研究發現TDRD1相分離活性缺失導致IMC無法組裝，piRNA生成量顯著下降，轉座子異常激活。這些結果證明了TDRD1相分離對于雄性生殖細胞中IMC的組裝以及功能發揮至關重要。

最后，研究人員發現TDRD1的相分離活性在脊椎動物中具有很強的保守性，而在非脊椎動物中并不保守。進一步研究發現非脊椎動物的TDRD1同源蛋白缺少C端coiled-coil結構域，因此無法發揮相分離的活性。研究人員的這一發現解釋了為什么IMC在脊椎動物生殖細胞中普遍存在，而在非脊椎動物生殖細胞中卻并不顯著。 

綜上所述，該研究揭示了TDRD1相分離活性的分子機制以及TDRD1相分離活性在生殖細胞中的IMC組裝、piRNA生成和轉座子沉默中的生理作用。該研究將相分離與哺乳動物生殖顆粒的組裝聯系起來，為研究生殖細胞中無膜細胞器的形成以及功能發揮提供了新的思路，對于進一步理解哺乳動物精子發生的調控機制具有重要意義。