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特發性炎性肌病相關間質性肺疾病動物模型簡介

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特發性炎性肌病(Idiopathic Inflammatory Myopathy,IIM)是一種病因不明的、以四肢近端肌肉受累和慢性炎癥為突出表現的異質性疾病,肌肉無力是其最典型的臨床表現。根據目前已知的不同IIM特異性自身抗體、臨床組織病理學和血清學特征,IIM可以分為皮肌炎(Dermatomyositis,DM)、抗合成酶綜合征(Antisynthetase Syndrome,ASS)、免疫介導壞死性肌病(Immune-mediated Necrotizing Myopathy,IMNM)、包涵體肌炎(Inclusion Body Myositis,IBM)和多發性肌炎(Polymyositis,PM)。隨著疾病的發展,不同程度的肌炎會使皮膚、肺、關節和心臟等多個系統及器官受累。間質性肺病(Interstitial Lung Disease,ILD)是IIM肺受累的最常見臨床表現。抗合成酶抗體(Anti-Synthetase Antibody,ASA)和肌炎特異性自身抗體(Myositis Specific Autoantibody,MSA)與IIM患者中ILD的發生密切相關。目前有較多針對IIM動物模型的研究,但IIM-ILD相關的動物模型卻鮮有報道。總結IIM和IIM-ILD相關的動物模型,旨在通過這些模型提高研究者對該疾病發病機制的理解和認識,并為未來開發具有針對性的治療方案提供參考。

IIM相關的動物模型:

實驗性自身免疫性肌炎模型

通過將同種肌肉勻漿混合完全弗氏佐劑(CFA),在豚鼠背部皮下多次免疫,建立實驗性自身免疫性肌炎(Experimental Autoimmune Myositis,EAM)動物模型。在SJL/J小鼠中通過勻漿或部分純化的肌球蛋白混合CFA誘導產生肌炎,SJL/J小鼠有dysferlin基因突變,可導致自發性肌肉壞死和繼發性肌肉炎癥,肌肉中浸潤的T細胞以CD4+T細胞為主。通過大鼠肌球蛋白和百日咳毒素(PT)兩次免疫接種,誘導BALB/c小鼠產生嚴重的自身免疫性肌炎,證實C蛋白是肌球蛋白中的主要免疫原。通過給B6小鼠單次皮下注射小鼠或人類的C蛋白片段混合CFA,同時腹腔內注射百日咳毒素,構建了C57BL/6(B6)小鼠EAM模型。

在前期EAM模型的基礎上進一步進行改良,提高了大鼠骨骼肌上清液的質量濃度(30 g/L)和百日咳毒素的量(2 ng/只),增大每次注射骨骼肌上清液與CFA劑量(0.5 m L/只),誘導BALB/c小鼠產生了更嚴重的肌炎和肺部病變。使用部分純化的豚鼠骨骼肌肌球蛋白誘導BALB/c產生EAM,90 d后剖殺取材。通過檢測血清自身抗體濃度,發現Ro-52、OJ、EJ、PL-12、PL-7、SRP、Jo-1、PM-Scl75和Ku抗體在模型組動物中高表達,而Scl100和Mi-2β抗體并未表達;肌纖維存在大量炎性細胞浸潤,小鼠肌肉力量測試顯示,第14天下降了50%,第90天下降了45%,提示小鼠出現了抗合成酶綜合征;與此同時,此模型發生ILD的比例較高,可模擬ASS臨床患者高發病率特征。

EAM的造模原理目前并未完全闡明,一般認為骨骼肌中C蛋白是小鼠產生免疫的主要肌源性抗原,可誘發強烈的自身免疫反應。此模型也被認為與人類PM相似,主要表現為肌肉組織炎性浸潤和肌纖維萎縮,同時近膜和血管周圍區域CD4+T細胞浸潤增加,是最早也是應用最廣泛的肌炎模型。部分EAM小鼠存在肺部損傷和病變,可部分模擬PM-ILD的臨床表現,但存在造模周期較長、無統一造模方法、ILD發病率不穩定等問題。

感染鼠模型

部分感染柯薩奇病毒B1(coxsackievirus B1,CVB1)的患者會出現骨骼肌病變,產生肌炎。CVB1是Picornaviridae家族(Enterovirus屬)的成員之一,是一種單股正鏈RNA病毒。柯薩奇病毒的致病機制取決于特定的病毒-受體相互作用。柯薩奇病毒腺病毒受體(CAR)和衰變加速因子(DAF)相互作用有助于CVB進入肌細胞,最終導致組織損傷。

接種CVB1的小鼠會發展成劑量依賴性、快速進展的近端后肢肌炎,死亡率高達30%。同時,接種羅斯河病毒(RRV)或基孔肯雅病毒(CHIKV)以及原生動物寄生蟲也會導致動物肌肉損傷。此動物模型特點主要表現為小鼠體質量減輕、活動減少和力量下降,同時血清肌酶水平增加,有肌纖維壞死、炎性細胞內膜浸潤等病理表現,目前主要用于模擬由病毒感染導致肌炎患者的臨床表現。此模型也可部分模擬臨床PM患者的肺部改變,但存在死亡率過高、模型構建需要病毒實驗操作條件等局限性。

含纈酪肽蛋白(Valosin-containing Protein,VCP)相關的IBM模型

在129/Sv Ev小鼠體內插入VCP突變R155H基因片段,得到了VCPR155H/+小鼠,結果發現在小鼠肌肉VCPR啟動子調節下,R155H突變的轉基因過度表達,肌肉病理學顯示肌纖維大小改變、內膜結締組織增加、線性嗜堿性邊緣裂紋以及肌漿和肌核液泡泛素顯示陽性;含甾蛋白(VCP)功能變異,導致致病性增加,其特征類似于人類IBM;雜合子小鼠在12個月左右出現進行性肌無力,細胞質TDP-43易位,15個月時泛素水平升高,泛素可以增強骨骼肌的自噬,加重骨骼肌的損傷;HE染色分析發現肌纖維空泡化,線粒體異常腫脹,同時肌纖維間質中發現炎性細胞浸潤。此模型主要用于研究泛素或VCP相關基因對肌炎的影響,但無ILD相關報道。

主要組織相容性復合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)高表達肌炎小鼠模型

使用MHC轉基因肌炎小鼠模型,利用5周齡小鼠飲用加入多西環素的水來誘導構建轉基因模型,在其9~13周齡進行剖殺,對小鼠肌肉組織進行HE染色發現,患有肌炎的小鼠顯示出較為嚴重的內臟炎癥和肌纖維炎癥浸潤,肌炎小鼠肌肉組織中Toll樣受體-7、Ⅰ型干擾素(IFN)和核因子(NF)-κB基因表達較野生型小鼠增加約80倍。此模型與臨床部分患者高Ⅰ型IFN和NF-κB表達相似,但無肺部損傷相關報道。

基因敲除導致的肌炎模型

缺乏突觸結合蛋白Ⅶ(SytⅦ)小鼠的胚胎成纖維細胞不易受到錐體蟲的侵襲,SytⅦ相關基因突變的小鼠皮膚和骨骼肌存在廣泛纖維化;研究者隨后構建了SytⅦ-/-基因敲除小鼠,發現小鼠各器官和肌肉存在廣泛的炎癥和纖維化灶,巨噬細胞和嗜酸性粒細胞浸潤明顯,同時伴隨有白細胞浸潤、骨骼肌廣泛纖維化、內膜膠原蛋白沉積、肌酸激酶升高和進行性肌無力。SytⅦ-/-基因敲除小鼠的病理表現與人類PM/DM非常相似,病變部位也主要發生在機械應激的組織、皮膚和骨骼肌中,在患者中也觀察到了類似的情況。這表明機械損傷是組織自身免疫性疾病病因學的一個重要因素,但并無SytⅦ-/-小鼠ILD相關報道。

MSA誘導的肌炎模型

轉錄中間因子1(TIF1)γ誘導的肌炎(TIF1γ-induced Myositis,TIM)模型

TIF1γ是一種在DM患者中檢測到的MSA。對B6小鼠每周皮下注射重組人TIF1γ蛋白與CFA乳化的免疫劑,連續注射4次,同時腹腔注射百日咳毒素加強免疫建立了TIM模型,免疫組化檢測顯示肌肉纖維中MHCⅠ類和Ⅰ型IFN反應分子Mx1的表達上調,同時出現大量CD8+T細胞浸潤和黏附,肌纖維出現萎縮和壞死。但此模型尚無ILD相關報道。

Jo-1誘導的ASS模型

抗Jo-1抗體陽性的IIM患者ILD發生率較高。人類組氨酰-t RNA合成酶(HRS/Jo-1)的氨基末端部分含有免疫顯性B和T細胞表位。用Jo-1和麥芽糖結合蛋白(Maltose-binding Protein,MBP)生成重組融合蛋白,包括用小鼠Jo-1和人類Jo-1基因產生的結合蛋白(分別為MA/MBP和HA/MBP),用于隨后的免疫試驗;用人或鼠HRS蛋白免疫B6.G7(NOD I-Ag7MHCⅡ類位點交叉到C57BL/6背景)和NOD.Idd3/5(C57BL/6胰島素依賴型糖尿病Idd3/5非MHC位點轉入到NOD背景)小鼠,評估HRS定向的B細胞和T細胞反應在抗合成酶綜合征中的作用及小鼠的肺部損傷情況;用HA/MBP或MA/MBP與CFA乳化,之后免疫B6.G7小鼠,8周后剖殺,經HE染色股四頭肌切片發現,相比于單純CFA免疫,HA/MBP或MA/MBP免疫的小鼠更易出現內臟炎癥和肌肉纖維侵襲或退化。m HRS可溶性衍生物可刺激產生肌肉免疫,這種自身抗原可以觸發先天免疫反應,證明了這些免疫反應可以繞過BCR和TCR信號,在新的IIM模型中產生嚴重的肌肉炎癥。該模型在多個小鼠菌株中具有高度可重復性,證明這種抗原具有內在的免疫刺激特性,此模型也為更好地了解IIM的發病機制提供了可能。

IIM相關ILD動物模型:

目前單純ILD動物模型構建主要是以博來霉素(BLM)、二氧化硅、輻射等理化物質誘導肺纖維化形成,其中BLM使用最廣泛。BLM是一種水溶性糖肽抗生素,因其可導致肺纖維化而用于實驗性肺纖維化的誘導劑。氣管滴注BLM是標準給藥途徑,會造成中央支氣管周圍纖維化,細胞外基質膠原過度沉積、肺泡塌陷,肺泡和支氣管壁增厚等,與IPF患者表現相似。背部皮下注射BLM可模擬SSc-ILD。BLM誘導的IPF具有復制性高、時間短、癥狀明顯等優點,但在嚙齒類動物模型中,肺纖維化可能會在28 d后自發退化。且BLM誘導的IPF是化學損傷后的肺纖維化,這與由肌炎引起的ILD并不相同。因此,構建肌炎引起的ILD模型尤為重要。在目前所有報道的肌炎模型中,EAM肌炎模型、感染鼠模型、人Jo-1誘導鼠模型和人MDA5轉基因小鼠誘導的肺損傷模型中有ILD相關病理改變,下文將進行詳細論述。

肌肉勻漿誘導的EAM-ILD模型

肌肉勻漿誘導的改良EAM模型中,第5周剖殺發現BALB/c小鼠出現肺損傷,肺組織病理可見小鼠肺泡炎細胞浸潤,肺泡間隔水腫、變寬,以及明顯的肺泡塌陷;肺組織內可見成纖維細胞過度增殖和髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)高表達(MPO是中性粒細胞的標志物);在此研究基礎上,研究人員在第21、28天腹腔注射中性粒細胞,發現小鼠出現了更為嚴重的肺纖維化(Pulmonary Fibrosis,PF)癥狀,典型的病理過程包括早期肺泡上皮細胞損傷和肺泡中巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞聚集引起的明顯炎癥反應;之后,成纖維細胞的增殖明顯,大量膠原沉積,導致蜂窩肺的形成。此模型在一定程度上模擬了臨床患者肺成纖維細胞的過度增殖與中性粒細胞的浸潤,中性粒細胞形成的中性粒細胞胞外陷阱(NETs)會損害內皮細胞和上皮細胞,從而損害肺功能并加速慢性阻塞性肺疾病的進展。該研究提示中性粒細胞在IIM患者的ILD發展中可能起到重要的作用。此模型與PM患者具有一定的相似性,同時具有操作簡易、癥狀明顯等優點。

肌球蛋白誘導的EAM-ILD模型

使用部分純化的豚鼠骨骼肌肌球蛋白誘導EAM,在初次免疫90 d后剖殺小鼠,發現肌球蛋白可以使小鼠產生嚴重的肌炎反應,同時出現肺部損傷;通過HE和Masson三色染色發現,支氣管周圍出現大量炎性細胞浸潤,存在過量膠原沉積,出現纖維化病灶;檢測支氣管肺泡灌洗液發現,白細胞介素(IL)-1β、IL-6、C反應蛋白(CRP)和轉化生長因子(TGF)-β1的蛋白表達水平與健康小鼠相比顯著升高。其他研究也證明這些細胞因子在ILD背景下通常會有顯著提高。分析肺部的蛋白表達發現TGF-β1介導的纖維化信號通路處于激活狀態。TGF-β1被認為是這一現象中驅動肺泡上皮細胞間質轉化的主開關。此模型提示IIM-ILD可能與TGF-β1介導的纖維化信號通路過度激活相關。同時首次發現肌球蛋白誘導的小鼠肌炎模型出現了ASS相關抗體,可部分模擬ASS患者出現的抗合成酶抗體,但造模時間較長(90 d),且無法得知ILD的具體發病時間和持續時間,使藥物篩選和治療存在不可控因素。

CVB1病毒誘導的多發性肌炎豚鼠模型及其肺間質改變

向雌性短毛豚鼠腹腔內注射0.5 m L的半數組織培養感染劑量(TCID50)效價為1×10-3的CVB1病毒,連續3周背部皮下注射CFA與完全乳化的兔肌均質物進行免疫,于初次免疫4周后剖殺,發現小鼠存在肺部損傷,但ILD具體發病時間和持續時間未知;組織學研究表明豚鼠肺部組織中出現CD68+T、CD8+T細胞大量浸潤;肺組織蛋白表達檢測發現免疫小鼠組織蛋白酶B(Cathepsin B,CB)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和TGF-β1蛋白表達量顯著增加;同時豚鼠肺部出現炎性細胞浸潤、肺泡間隔擴大和肺間質纖維化。先前的研究表明,人類半胱氨酸蛋白酶與肺損傷有關,是肺炎的重要參與者,其中CB可以通過調控先天免疫的關鍵蛋白質的表達來發揮免疫調節功能。抑制CB的過量表達可以緩解CVB1病毒誘導的多發性肌炎豚鼠肺泡上皮細胞凋亡,防止上皮細胞丟失。此模型也是首次表明CB活性與PM/DM-ILD的纖維化有關,并與疾病嚴重程度相關。感染鼠模型可以在一定程度上模擬因為感染病毒所導致的肌炎,特別是此模型與PM-ILD患者肺部癥狀相似度高。此模型有較強的臨床相關性。

肌炎自身抗體誘導的ASS-ILD模型

Jo-1誘導的ASS-ILD模型

采用HA/MBP或MA/MBP免疫B6.G7小鼠,8周后剖殺,檢查肺組織病理和肌肉病理切片并HE染色,結果發現用MA/MBP免疫的B6.G7小鼠有70%表現出肺部炎性細胞灶,或在肺部氣管、肺動脈分支和血管周圍出現更嚴重的炎性細胞密集浸潤;但用HA/MBP免疫的B6.G7小鼠肺部炎性細胞灶較少,發病率較低(約45%)。接種MA/MBP的NOD.Idd3/5小鼠也會出現肌肉和肺部炎癥,但與B6.G7小鼠不同,NOD.Idd3/5小鼠需要通過注射OX86(一種純化的大鼠Ig G1,OX40激動劑)進行額外的共刺激才能夠引發明顯的肌肉或肺部病理改變。OX40共刺激可以消除Jo-1免疫時的相對物種特異性,并使接種HA/MBP的NOD.Idd3/5小鼠對小鼠Jo-1抗體的交叉識別更大。這種對共刺激的依賴反映了OX40信號對抗原特異性效應器/記憶T細胞功能和存活率的增強作用。

該模型使用已知的自身抗原來誘導疾病,復制了人類ASS的特征,可模擬全身肌病及其并發癥的發展,特別是70%的免疫小鼠出現了類似于抗Jo-1抗體陽性ILD患者的特征。因此,該模型的完善對于研究IIM-ILD的病理過程至關重要。

人MDA5轉基因小鼠誘導的肺損傷

在臨床中,抗MDA5抗體陽性的DM患者的ILD發病率達到90%以上。利用人抗MDA5抗體和人類MDA5轉基因小鼠模擬臨床抗MDA5抗體患者所出現的肺組織損傷,建立了一個新的自身抗體誘導的肺損傷轉基因小鼠模型,并將全長人MDA5 c DNA生成并亞克隆到含有SP-C啟動子、SV40小T內含子和polyA信號的3.7SPC/SV40載體的Sal I位點,并被指定為SPC-MDA5,將Nde I和Not I消化的線性DNA片段注射到BDF1小鼠受精卵中,使用此轉基因小鼠與B6小鼠交配產生半合子Tg小鼠,培育出了人MDA5轉基因小鼠;研究者還用芽孢病毒Ac NPV和p PSC8/人類MDA5共感染的SF9細胞中分離出重組人MDA5蛋白。用重組人MDA5蛋白免疫特異性無病原體兔,使用蛋白G柱從免疫兔血清中純化得到抗人MDA5抗體。

用抗MDA5多克隆抗體每周免疫1次,共4周,在第28天和第56天剖殺小鼠進行組織學檢查,發現小鼠于28 d剖殺時即出現ILD癥狀,56 d時ILD持續加重,但ILD的發病時間和持續時間未知;用抗MDA5多克隆抗體免疫的轉基因小鼠肺泡間隔出現大量淋巴細胞浸潤,肺泡結構被破壞,肺泡塌陷;免疫組化顯示人MDA5蛋白在免疫的轉基因小鼠的肺泡上皮和肺泡巨噬細胞出現表達,同時Ig G、Ig M、Ig A和補體C3在免疫小鼠的肺部均強烈表達,而Ig G、Ig M、Ig A和補體C3在肺泡上皮中強烈表達與臨床較為吻合。此模型的出現也為進一步揭示抗MDA5自身抗體在IIM-ILD患者疾病進展中的作用奠定了基礎。

小結

目前尚無單一的動物模型能完全再現IIM-ILD的臨床和病理特征,特別是各種模型ILD的發病時間、持續時間或能否自然消退等并沒有詳細的研究。但在過去幾年中IIM-ILD仍取得了很大的進展,特別是針對抗合成氨酶抗體相關的動物實驗的開發。希望未來構建出相對簡易、經濟、全面反映人IIM-ILD特征的動物模型,也希望正在開發的動物模型能繼續闡明IIM-ILD不同亞群的免疫發病機制,為新治療靶點的研發奠定基礎。

Source: 天津醫藥. 2024,52 (07),特發性炎性肌病相關間質性肺疾病動物模型概述

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