古代醫(yī)家就肝病有無(wú)補(bǔ)法存在著不同看法，明代醫(yī)家劉純?cè)凇夺t(yī)經(jīng)小學(xué)·卷之四》提出“肝為相火，有瀉無(wú)補(bǔ)”。分析《名醫(yī)類(lèi)案》《續(xù)名醫(yī)類(lèi)案》8 000余醫(yī)案，未見(jiàn)補(bǔ)肝陽(yáng)、少見(jiàn)補(bǔ)肝氣。隨著清代和近現(xiàn)代醫(yī)家對(duì)中醫(yī)理論的辨析，以及當(dāng)代中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程的深入推進(jìn)，學(xué)界對(duì)肝虛證的認(rèn)識(shí)已大為不同，從氣、血、陰、陽(yáng)論治肝虛證的理論探討、臨床及實(shí)驗(yàn)研究也日漸豐富。在中醫(yī)現(xiàn)代化進(jìn)程中，證候動(dòng)物模型的創(chuàng)制成為一項(xiàng)關(guān)鍵工作，中醫(yī)證候動(dòng)物模型對(duì)于中醫(yī)證本質(zhì)研究、中藥復(fù)方及中藥制劑的藥效和藥理學(xué)研究等工作都具有重要意義。下述總結(jié)近年來(lái)肝虛證動(dòng)物模型構(gòu)建現(xiàn)狀，以期為建立更符合中醫(yī)理論及臨床實(shí)際的肝虛證動(dòng)物模型提供思路。
陰虛證動(dòng)物模型
“肝體陰用陽(yáng)”是歷代醫(yī)家在陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)基礎(chǔ)上結(jié)合臨床辨治經(jīng)驗(yàn)歸納總結(jié)出的生理病理特點(diǎn)，肝陰和肝血是肝生理活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，故“體陰”；生理功能表現(xiàn)為肝陽(yáng)和肝氣，故“用陽(yáng)”。丹溪學(xué)派的中心學(xué)術(shù)思想是“陽(yáng)有余陰不足論”，即“人受天地之氣以生，天之陽(yáng)氣為氣，地之陰氣為血，故陽(yáng)常有余，陰常不足，氣常有余，血常不足”。古代醫(yī)家曾提出“肝為五臟之賊”，經(jīng)方大家岳美中先生也曾有“臨床所見(jiàn)雜病之中，肝病十居六七”之說(shuō)，肝陰虛證是臨床多種病癥常見(jiàn)證候，不獨(dú)見(jiàn)于中醫(yī)肝病和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)肝膽病。肝虛證病機(jī)在于多種原因引起津液、營(yíng)血、陰精耗損，不能榮養(yǎng)臟腑經(jīng)絡(luò)，子盜母氣、累及腎臟則出現(xiàn)肝腎陰虛證。同時(shí)，津液、營(yíng)血、陰精同源化生，陰虛、血虛、精虛可相互轉(zhuǎn)化、兼夾，肝陰虛可致肝血虛或精血虧虛，血虛日久也可導(dǎo)致肝陰虛。因此，研究者根據(jù)“體陰”的生理病理特點(diǎn)，創(chuàng)建了肝陰虛證、肝腎陰虛證、肝血虛證、肝腎精血虧虛等動(dòng)物模型。
通過(guò)分析1991年至2003年46篇?jiǎng)游镪幪撟C模型相關(guān)文獻(xiàn)，將陰虛模型制備歸納為甲狀腺激素類(lèi)（單用、聯(lián)合利血平或聯(lián)合其他藥物）造模、腎上腺皮質(zhì)激素（常用氫化可的松）造模、超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)（游泳或聯(lián)合番瀉葉）造模、長(zhǎng)期激怒法造模、手術(shù)（狹窄左腎動(dòng)脈）造模、特殊環(huán)境（濕熱人工氣候室）造模、高鹽飲食造模、化學(xué)性肝損傷聯(lián)合溫燥性中藥造模、大腸桿菌內(nèi)毒素造模。但是46篇陰虛證模型文獻(xiàn)中報(bào)道的臟腑定位并不統(tǒng)一，大多為腎陰虛；同時(shí)也存在同樣造模方法被不同研究者分別歸結(jié)為腎陽(yáng)虛、腎陰虛。文獻(xiàn)中采用化學(xué)性肝損傷聯(lián)合溫燥性中藥造模后認(rèn)為其模型為肝陰虛證大鼠，方法為40%四氯化碳（CCl4）花生油0.3 ml/100 g皮下注射2次/周，5周后改為1次/周，同時(shí)第5、6周聯(lián)合附子、肉桂、干姜復(fù)方（1∶1∶1，生藥18 g/kg/d）灌胃1次/d。余下研究中，除以長(zhǎng)期激怒法造模，并認(rèn)為模型屬于大鼠肝腎陰虛證模型外，其他研究者或?qū)⒛Ｐ蜌w屬于腎陰虛證，或未言明臟腑定位。
肝陰虛證動(dòng)物模型
近10年以來(lái)，文獻(xiàn)報(bào)道的肝陰虛證動(dòng)物模型均采用化學(xué)性肝損傷聯(lián)合其他藥物或情志刺激建立。
采用CCl4橄欖油溶液聯(lián)合甲狀腺片混懸液制備肝陰虛模型，分別給予實(shí)驗(yàn)小鼠20%、10%、5% CCl4橄欖油溶液腹腔注射和甲狀腺片混懸液灌胃以確定CCl4最佳劑量，并通過(guò)血清、肝臟代謝物多元統(tǒng)計(jì)分析鑒定肝陰虛潛在生物標(biāo)記物。研究發(fā)現(xiàn)，CCl4最佳劑量為20%；模型小鼠血清ALT、AST、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、cAMP/環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）比值、TNF-α、IL-6顯著升高，IL-10降低，cGMP、SOD顯著降低；肝陰虛潛在生物標(biāo)記物包括252個(gè)血清差異代謝物和229個(gè)肝臟差異代謝物，涉及核苷酸代謝、嘌呤代謝、類(lèi)固醇激素生物合成、嘧啶代謝、初級(jí)膽汁酸生物合成、花生四烯酸代謝等代謝等通路。
采用腹腔注射20% CCl4橄欖油溶液聯(lián)合甲狀腺片灌胃制備肝陰虛證大鼠模型，通過(guò)測(cè)量大鼠體質(zhì)量、肛溫、舌面干濕度、攝食量、攝水量，觀察動(dòng)物易激惹程度、毛發(fā)光澤度、小便顏色、大便顏色及質(zhì)地等指標(biāo)并進(jìn)行評(píng)分，綜合評(píng)定肝陰虛證模型大鼠證候表征。研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠體質(zhì)量降低、肛溫升高、24 h攝食量增加，白芍總苷、白芍多糖能夠調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸含量、雌二醇（E2）和皮質(zhì)類(lèi)固醇水平以及能量代謝，研究者認(rèn)為這在一定程度上揭示了白芍養(yǎng)肝陰的科學(xué)內(nèi)涵。
采用文獻(xiàn)慢性肝損傷聯(lián)合溫燥性中藥造模方法復(fù)制大鼠肝陰虛證模型，以大鼠體質(zhì)量、易激惹程度、毛發(fā)光澤度、小便顏色、大便顏色質(zhì)地、肛溫等作為肝陰虛證候指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)白芍多糖能夠改善模型大鼠大便干燥程度，白芍總苷能夠明顯改善模型大鼠體征評(píng)分、顯著提高大鼠體質(zhì)量。研究者認(rèn)為，白芍總苷抗炎、減輕微循環(huán)障礙、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-6和IL-10平衡可能是白芍養(yǎng)肝陰的物質(zhì)基礎(chǔ)。
采用Lieber-DeCarli酒精液體飼料加甲狀腺激素灌胃制備小鼠酒精性肝損傷肝陰虛證模型，模型小鼠體重明顯減輕、體溫升高、心率加快、毛發(fā)無(wú)光澤，出現(xiàn)疲倦易困、煩躁易怒等肝陰虛證候。白芍水提液灌胃（4.3 g/kg）能夠改善模型小鼠肝功能、降低肝組織脂質(zhì)占比、改善肝細(xì)胞壞死程度，療效機(jī)制可能與調(diào)節(jié)cAMP/cGMP水平及細(xì)胞因子水平、恢復(fù)肝細(xì)胞功能與代謝平衡、增強(qiáng)肝臟乙醇代謝關(guān)鍵酶及抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、減少脂質(zhì)沉積有關(guān)。
肝腎陰虛動(dòng)物模型
肝腎陰虛證是臨床常見(jiàn)中醫(yī)證型，研究者開(kāi)展了多種疾病肝腎陰虛證模型的建立和研究工作。
以慢性激怒應(yīng)激法制造大鼠肝腎陰虛證模型，發(fā)現(xiàn)肝腎陰虛證大鼠促甲狀腺激素釋放激素分泌增加，垂體、血清促甲狀腺激素降低，血清游離甲狀腺素降低而反三碘甲狀腺原氨酸增高，加味一貫煎能夠影響模型大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸，改善上述指標(biāo)。樊蔚虹等進(jìn)行了長(zhǎng)期激怒法與化學(xué)藥物法、溫燥藥法所制造肝腎陰虛模型進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期激怒法大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，飲水量、尿量減少而體溫相對(duì)恒定，血漿cAMP下降，E2與睪酮（T）比值升高。研究者提出，長(zhǎng)期激怒法所造模型無(wú)人為所致內(nèi)分泌紊亂，更接近臨床實(shí)際，是肝腎陰虛證的最佳造模方法。
模擬高脂血癥及中醫(yī)肝腎陰虛證的病因，采用高脂飲食聯(lián)合長(zhǎng)期激怒建立高脂血癥大鼠肝腎陰虛證動(dòng)物模型。模型大鼠出現(xiàn)明顯消瘦、活動(dòng)減少、豎毛少澤、食欲減少、弓背、扎堆等現(xiàn)象，血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白-膽固醇顯著升高，血漿cAMP含量升高、E2和E2/T比值顯著升高。研究者認(rèn)為該模型大鼠表現(xiàn)出高脂血癥肝腎陰虛證的癥狀、體征，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)符合臨床實(shí)際。
采用100% CCl4腹腔注射1次聯(lián)合長(zhǎng)期激怒法建立急性肝損傷肝腎陰虛證病證結(jié)合大鼠模型，并從一般狀態(tài)、飲水量、進(jìn)食量、游泳時(shí)間、肛溫、唾液酸堿度、體重減輕、肝臟系數(shù)、肝功能、肝臟形態(tài)、肝組織病理等方面對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)該模型具有形體消瘦等陰虛證典型特征，同時(shí)具備肝損傷顯著、抗疲勞能力降低等肝的定位癥狀和虛損、尿液異常等腎的定位癥狀，研究者認(rèn)為該模型是理想的肝腎陰虛證病證結(jié)合動(dòng)物模型。采用左甲狀腺素鈉灌胃（150 μg/kg）聯(lián)合夾尾法情志刺激建立肝腎陰虛證候小鼠模型，模型小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、大便干硬、小便發(fā)黃、自主活動(dòng)增加、易激惹、反應(yīng)活躍、喜冷怕熱等虛熱癥狀。
利用晚期自發(fā)性高血壓大鼠（SHR），根據(jù)大鼠辨證方法學(xué)將四診信息轉(zhuǎn)化為具有同等意義的一般行為學(xué)指標(biāo)，認(rèn)為SHR大鼠午后肛溫較高、舌色偏紅、前爪抓握能力及肌力較差、學(xué)習(xí)記憶能力減退、血清T水平偏低及E2/T比值較高等特征基本符合肝腎陰虛證的表現(xiàn)，提出晚期SHR屬于肝腎陰虛證候。
采用腹腔注射化療藥順鉑（CDDP，3 mg/kg）建立卵巢功能早衰肝腎陰虛證小鼠模型，發(fā)現(xiàn)腹腔注射CDDP后小鼠體重減輕，進(jìn)食、飲水均減少，尿量減少，體溫升高，血漿cAMP含量升高；血清E2和孕酮水平降低，促卵泡生成激素和黃體生成素水平升高，卵巢排卵功能明顯受到抑制。研究者認(rèn)為模型小鼠生物學(xué)行為接近于臨床實(shí)際，內(nèi)分泌功能和生化指標(biāo)變化特征與臨床相似，是系統(tǒng)研究卵巢功能早衰肝腎陰虛證的適宜造模方法。
肝血虛證動(dòng)物模型
血虛證動(dòng)物模型多以化學(xué)藥物誘發(fā)溶血或減少血容量的方式建立，但現(xiàn)有研究均未談及臟腑定位，肝血虛證研究報(bào)告均為臨床研究，臟腑定位為肝的血虛證動(dòng)物模型報(bào)道極少。
早在1981年開(kāi)展了乙酰基苯肼（APH）誘導(dǎo)血虛動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究，探討皮下注射與腹腔注射對(duì)模型大鼠溶血和自然恢復(fù)情況的影響，由此開(kāi)創(chuàng)了化學(xué)藥物誘導(dǎo)血虛動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)方法。近年來(lái)，研究者在化學(xué)藥物的選擇、給藥劑量和方式上開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究，采用APH/環(huán)磷酰胺（CTX）復(fù)合因素建立血虛證動(dòng)物模型，采用CTX誘導(dǎo)血虛證，采用腹腔注射鹽酸苯肼建立了小鼠血虛證模型。復(fù)制APH誘導(dǎo)血虛證小鼠模型探討血虛證模型小鼠的證候物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)模型小鼠呈現(xiàn)虛弱征象，脾臟代償性增大、胸腺明顯萎縮，血液紅細(xì)胞形態(tài)異常、正常紅細(xì)胞數(shù)量減少、白細(xì)胞代償性增多，骨髓成熟的環(huán)狀核細(xì)胞減少，血清皮質(zhì)酮含量明顯升高；脾臟腫大、腎臟Epo基因代償性高表達(dá)以及繼發(fā)腎上腺皮質(zhì)功能虛性亢奮是該證候最突出的特征。
采用較長(zhǎng)時(shí)間放血與饑餓相結(jié)合的方法建立了家兔血虛模型，通過(guò)血液流變學(xué)和微循環(huán)、心鈉素等指標(biāo)結(jié)合補(bǔ)血中藥療效判定，該模型是一種簡(jiǎn)便、客觀、定量、可重復(fù)的血虛證模型。采用3.5 Gy60Co源γ射線全身一次性照射制備小鼠血虛證模型，以骨髓集落培養(yǎng)計(jì)數(shù)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位、紅細(xì)胞集落形成單位、爆裂型紅細(xì)胞集落形成單位、混合集落形成單位作為血虛證模型小鼠療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。
肝切除聯(lián)合睡眠剝奪建立的肝血虛失眠模型，模型大鼠表現(xiàn)為精神萎靡，易受驚，活動(dòng)量少，目光呆滯，雙目、口唇呈蒼白色，皮毛重度枯槁蓬亂、呈黃色，爪甲粗糙，抓取時(shí)無(wú)力反抗；中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)異常，下丘腦、腦干內(nèi)5-羥色胺和γ-氨基丁酸含量降低，多巴胺、去甲腎上腺素和谷氨酸含量升高。采用乳鼠皮下注射左旋谷氨酸單鈉聯(lián)合70%肝臟切除建立肝腎精血虧虛大鼠，模型大鼠肝再生度、肝細(xì)胞分裂指數(shù)、肝重/體重比值、骨髓有核細(xì)胞增生度、外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白均顯著下降，給予左歸丸補(bǔ)益肝腎精血?jiǎng)t上述指標(biāo)顯著改善，研究結(jié)果表明肝再生能力可作為觀察肝腎精血虧虛證的客觀化指標(biāo)。
陽(yáng)虛證動(dòng)物模型
明代及金元時(shí)期多有醫(yī)家認(rèn)為肝無(wú)氣虛、陽(yáng)虛之證，但早在《靈樞·本神》有云：“肝氣虛則恐，實(shí)則怒”，肝氣虛證與情志密切關(guān)聯(lián)。氣屬陽(yáng)，肝氣虧虛、虛損嚴(yán)重則進(jìn)展為肝陽(yáng)虛。肝氣虛是指肝氣升發(fā)之力不足，溫煦、調(diào)暢之力下降所引起的一系列證候表現(xiàn)，而肝陽(yáng)虛則是在肝氣虛的病理基礎(chǔ)上發(fā)生肝陽(yáng)漸衰之證，歷代醫(yī)典中已收錄并闡述其證候表現(xiàn)及治法。然而，受丹溪學(xué)派影響，宋金元時(shí)期之后醫(yī)家鮮少提及肝氣虛、肝陽(yáng)虛，并提出“肝常有余”、“肝無(wú)補(bǔ)法”等說(shuō)法。直至清代、近代，補(bǔ)肝法重新涵蓋補(bǔ)肝氣、補(bǔ)肝陽(yáng)，張錫純?cè)卺t(yī)案中明確記載肝氣虛證，提出“補(bǔ)肝氣非黃芪不能”的觀點(diǎn)。
肝陽(yáng)虛證、氣虛證動(dòng)物模型研究極少，僅見(jiàn)聯(lián)合應(yīng)用利血平注射液腹腔注射與氫化可的松注射液肌肉注射建立肝腎陽(yáng)虛型抑郁大鼠模型，觀測(cè)大鼠體重、攝食量、飲水量、抓力、敞箱水平穿越數(shù)和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)、腋溫等，以體重、糖水?dāng)z入量、血清cAMP含量、cAMP/cGMP比值等作為肝腎陽(yáng)虛證量化指標(biāo)。采用圖像處理軟件選取爪、尾照片特定區(qū)域提取色度R、G、B，根據(jù)公式r=R/（R+G+B）計(jì)算r值以進(jìn)行計(jì)量化辨證，評(píng)估模型大鼠陽(yáng)熱、氣虛、陰虛和血虛程度。研究者依據(jù)利血平藥性為寒涼、歸肝經(jīng)的理論探討，以及小鼠皮下注射后出現(xiàn)體重逐漸減輕、活動(dòng)減少、畏寒、拱背、便溏等陽(yáng)虛癥狀的研究報(bào)告，提出利用利血平所制作的動(dòng)物模型屬肝陽(yáng)虛。
綜上所述，肝虛證動(dòng)物模型構(gòu)建和研究工作均有待進(jìn)一步推進(jìn)和完善。內(nèi)經(jīng)描述了五臟之中肝的位置、大小，與現(xiàn)代解剖學(xué)之肝臟基本一致，而肝體、肝用之說(shuō)則反映了氣、血、陰、陽(yáng)等物質(zhì)基礎(chǔ)是發(fā)揮生理功能的載體。因此，借助現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究技術(shù)構(gòu)建中醫(yī)證候動(dòng)物模型，以解剖學(xué)肝臟作為肝藏象物質(zhì)基礎(chǔ)研究的切入點(diǎn)，闡釋氣、血、陰、陽(yáng)等物質(zhì)基礎(chǔ)的生物學(xué)本質(zhì)及其承載“肝用”的科學(xué)內(nèi)涵，對(duì)于推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程具有積極意義。
Source: 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志. 2024, 34 (04)；肝虛證動(dòng)物模型構(gòu)建現(xiàn)狀
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