大动物实验-动物试验中心-临床前研究「江苏美凤力医疗科技有限公司」

編者：資源增量是實驗動物科技發展的核心任務，是實驗動物對生命科學研究提供支撐和服務的基礎和保障。自上世紀80 年代以來，我國老一輩實驗動物科學家苦心孤詣，在實驗動物資源研發工作中取得的多項開創新成果。

1988 年《實驗動物管理條例》發布實施，在實驗動物工作規范化、法制化管理，保障實驗動物和動物實驗的質量，推動我國科技發展和民生保障等方面發揮了重要作用。特別是在實驗動物資源標準化、新品種/品系開發和動物模型創制方面，取得了令人矚目的成果。

為此，借“科技資訊”之窗，陸續推出我國實驗動物專家在此領域所作的工作及取得的應用成果。

實驗用果蠅的標準化

倪健泉

清華大學醫學院基礎醫學系

黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）是100 多年前由Thomas Hunt Morgan 引入，作為模式生物進行科學研究的(Morgan, 1910)。此后，隨著遺傳學方法的發展，果蠅引領了許多生物學新發現(Bellen et al., 2010)。

如今，果蠅已經被廣泛用于各個生物學領域，包括人類疾病和治療方法的研究(Pandey and Nichols, 2011)。

一、果蠅的主要生物學特性

1、基本生物學特性

果蠅成蟲身長約2-2.5mm，雌性約重1.4mg，雄性約重0.8mg(Ong et al., 2015)。在10℃-30℃溫度區間果蠅可以生存，溫度越高，其生命周期越短(賀爭鳴等, 2016.5)。25℃培養條件下，果蠅生命周期（從胚胎發育到成蟲）約10 天，其中胚胎、幼蟲、蛹分別經歷約1d、5d、4d(張鵬飛，毛玉蕊，楊繞華，孟琳琳，王進忠，魏艷敏, 2010)。羽化后24 小時內果蠅即可交配，交配后雌果蠅每天可產卵達100 枚。條件適宜、營養充足的情況下，果蠅壽命可達2-3 個月。

2、果蠅的飼養和遺傳學操作

根據日常需要，果蠅可飼養于培養管或培養瓶中，底部放置玉米面、白糖、瓊脂、抗生素等制備的培養基(王霞，喬歡歡，潘麗霞，任興杰，孫錦，徐榮剛，劉魯萍，賀爭鳴，倪建泉, 2016)。由于目前尚無有效的冷凍并復蘇成蟲或幼蟲的方法，因此世界上各大果蠅資源中心以及1800 多個果蠅實驗室的種質資源保存都采用持續將成蟲轉移到新鮮培養基的方法。實驗室種質保存可將果蠅飼養于18℃、60%濕度、12h/12h 交替光照的培養箱或房間，則其生命周期可達20 天左右，可一個月傳代一次。實驗用果蠅飼養于18℃/25℃/29℃、60%濕度、12h/12h 交替光照的培養箱或房間，可利用不同溫度實現不同實驗目的（例如控制Gal4 表達量、控制Gal80ts 表達等）。實驗完成后，將廢棄果蠅連同培養管或培養瓶放入-20℃冰箱冷凍過夜，保證果蠅全部死亡后，可作為普通實驗垃圾處理。

進行遺傳學操作時，傳統方法是使用乙醚或乙醚與乙醇混合物將果蠅麻醉后再進行，但是存在麻醉效果不好、昏迷時間短、復蘇率低、對人體安全性差等問題。目前大部分果蠅實驗室采用高壓二氧化碳氣體，經過減壓閥處理后，通過麻醉槍和通氣麻醉平板進行果蠅麻醉處理。同時配套使用壁式加濕系統對二氧化碳進行預加濕，避免操作過程中靜電的影響。該方法操作簡單，對果蠅無傷害，且去除二氧化碳后果蠅復蘇迅速。

3、果蠅基因組及染色體

果蠅是最好的遺傳學研究工具之一。一方面，果蠅基因組僅由四條染色體組成，遺傳學操作簡單；而且果蠅基因組已經全部進行了測序和注釋(Adams et al., 2000)，遺傳背景清楚。另一方面，果蠅擁有成熟、強大的遺傳學工具體系和品系資源，比如Gal4/UAS 系統、嵌合體技術、近年來發展起來的基因組編輯和基因激活技術，以及轉基因干擾品系資源庫等，這是其他模式生物望塵莫及的。果蠅基因組編碼14000 多個基因，其中95％的基因集中在X、Ⅱ和Ⅲ號染色體上(Emameh et al., 2015; Ong et al., 2015)。這些基因與人類高度同源：50%以上的果蠅基因與人類同源，而75%以上的人類致病基因能在果蠅中找到同源物(Emameh et al.,2015; Sun et al., 2013)。果蠅基因不僅與人類基因序列保守，功能上也具有非常高的相似性。比如，參與基因表達和代謝調節的許多果蠅蛋白質與人類對應物具有密切的相似性。此外，基因組分析顯示，果蠅中很多重要生化途徑的生物合成網絡與人類具有良好的對應關系(Ong et al., 2015)。一百多年以來，利用果蠅進行生物醫學研究做出了許多開創性的發現，例如干細胞微環境的概念最初就是在果蠅中提出的。

二、實驗用果蠅的要求

實驗用果蠅一般需從國際公認的果蠅資源中心訂購，如美國的Bloomington Drosophila Stock Center、日本的NIG、以及我國的清華大學果蠅中心，以保證基因型正確、遺傳背景清晰、無微生物（細菌、霉菌、螨蟲等）污染。引入果蠅后，需對果蠅的表型進行確認，必要時可結合PCR、測序等方式進一步確認。此外，將果蠅飼養于合適溫度和濕度條件，保證其長勢良好。使用前，需要經過正規的隔離檢查，保證無污染后方可放入實驗室正式使用。我國目前尚無針對實驗用果蠅的技術規范和明確規定，相關規定參照國家檢驗檢疫總局發布和實施的《實驗動物引種技術規程》和《實驗動物質粒控制要求》等文件。

三、實驗用果蠅的應用研究

果蠅飼養容易、生命周期短，與其他短世代模型生物相比，卻擁有更多的組織和細胞類型，以及豐富的、方便觀察的表型和個體行為，因此為生命發育、成體健康、個體行為甚至進化等科學問題的探索提供理想的材料。此外，百余年來積累的遺傳學方法和資源為眾多生物過程的研究提供了巨大的便利。利用果蠅進行的研究使我們在遺傳學、細胞和發育生物學、神經生物學和行為學、分子生物學、進化學和人口遺傳學，以及其他領域取得了長足的進步(Hales et al., 2015)。

利用模式生物進行生命科學研究的最終目的是服務人類，幫助預防和治療人類重大疾病。果蠅不僅在基礎研究領域至關重要，加深了我們對于眾多生物過程中信號通路和分子機制的理解，而且在生物醫學領域也為人類疾病的干預策略提供了重要的參考依據。利用果蠅，研究人員建立了許多人類重大疾病模型，并用于探究發病機理和治療措施。例如，隨著老年人口比例增加，全世界神經退行性疾病發病率逐年增加，給家庭和社會帶來巨大的負擔。針對此問題，通過過表達人源顯性可遺傳疾病基因，建立了一系列神經退行性疾病的果蠅模型，包括阿爾茲海默癥、帕金森綜合征和亨廷頓舞蹈癥。這些疾病模型不僅能夠在組織和細胞水平上模仿人類的主要病理特征，還能通過幼蟲和成蟲的嗅覺學習、求偶、攻擊和晝夜節律等行為從系統水平模擬人類神經退行性疾病的功能退化(Fernandez-Funez et al., 2015; Rincon-Limas et al., 2012)。利用這些模型進行的研究，不僅加深了人們對于疾病發生發展過程的理解(Bodai et al., 2012; Campesan et al., 2011; Fernandez-Funezet al., 2015; Varga et al., 2014)，而且為探索疾病的治療方法做出了巨大的貢獻(Jansen et al., 2014;McGurk et al., 2015)。

除了神經退行性疾病，在果蠅中建立模型并進行深入研究的人類疾病還有免疫類疾病如哮喘、病原菌感染疾病、金屬中毒等(Calap-Quintana et al., 2017; Lestradet et al., 2014; Roeder et al., 2012)，代謝類疾病如肥胖及糖尿病、高糖飲食引發的心血管疾病等(Na et al., 2013; Teleman et al., 2012)，腫瘤如眼睛腫瘤、腸道腫瘤、卵巢腫瘤等(Bennett et al., 2015; Eliazer et al., 2011; Kirilly and Xie, 2007;Markstein et al., 2014; Richardson and Portela, 2018; Song and Lu, 2011; Sonoshita and Cagan, 2017;Yang et al., 2017)，以及衰老、皮膚病等其他疾病研究(Bohnekamp et al., 2015; Brandt and Vilcinskas,2013)。果蠅疾病模型不僅可以在細胞和分子水平上很好地模擬人類發病機制，而且利于進行行為學觀察和統計學分析，其強大的遺傳學工具和品系資源更是為揭示參與疾病的基因、信號通路、開發疾病治療方法并應用到人類提供了極大的便利。

四、實驗用果蠅種群的建立與意義

近二十年來基因組學的發展一方面使人們得到了各物種全基因組序列，另一方面對于這些零碎化的基因序列及其功能的認識和解讀卻遠遠不足。作為研究最深入的多細胞生物和可靠的人類疾病模型，果蠅中表型明確的基因也僅僅占其基因組編碼基因的約15%(Perkins et al., 2015)。因此，大量功能未知的基因和信號通路及其相互之間的作用關系仍需我們去探索。

百余年來，果蠅在各生物醫學領域的研究經久不衰，除了其自身生物學特性外，最突出的優勢便是一百年來果蠅研究積累的強大的遺傳學工具及品系資源。例如，轉基因RNAi 技術的出現使得我們可以及其便利地實現體內單個基因的表達調控。為了更加便利地實現全基因組任何一個基因的表達調控和研究，果蠅全基因組水平的轉基因RNAi 品系也應運而生，它們存在于奧地利的VDRC（http://stockcenter.vdrc.at/control/main）、日本的NIG（http://www.shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/index.jsp）、美國的BDSC（https://bdsc.indiana.edu/index.html）和中國的THFC（http://fly.redbux.cn/）。這些品系涵蓋了絕大部分果蠅基因，能夠滿足大部分研究人員需要。以BDSC 為例，她擁有11000 多個基因的轉基因RNAi 品系，覆蓋了71%的果蠅編碼基因(Perkins et al., 2015)。在RNAi 品系的技術原理方面，VDRC 和NIG 主要是利用前兩代果蠅轉基因RNAi 技術構建的長鏈RNA 干擾品系，BDSC 主要是利用第三代轉基因RNAi 技術構建的短鏈發卡RNA 干擾品系。清華果蠅中心（THFC）在原有8000 余株從TRiP 引進的品系外，又利用自主研發的新一代轉基因干擾技術構建了3000 余株與人類高度同源基因及重大疾病基因的新轉基因干擾品系（Qiao Huanhuan etal., Nature Communications, accepted）。與原有前三代RNAi 技術構建的品系相比，這些新品系降低了與Gal4 雜交前的本底表達，提高了RANi 誘導后的基因敲低效率，并且實現了一次性敲低多個基因，因此尤其適合那些高表達、高拷貝的基因以及蛋白質復合體的研究。

近幾年來，基于CRISPR/Cas9 系統的基因組編輯技術及基因轉錄激活技術有了長足的進步，使得果蠅基因表達調控方式更加多元化，為基因功能的研究提供了新的選擇。其中，基于CRISPR/Cas9 的基因編輯技術可以實現高效的基因突變、插入和同源重組(Ren et al., 2013; Ren et al., 2014a; Ren et al., 2014b)。清華大學果蠅中心與哈佛醫學院合作研發的CRISPR/dCas9 介導的VPR 及系列flySAM 系統，可實現高效的基因原位激活。隨著果蠅遺傳學新技術的不斷更新，配套的全基因組果蠅品系資源也成為新的迫切需求。實際上，將Gal4/UAS 系統與CRISPR/Cas9 技術結合，可以實現組織特異性的基因敲除或基因激活，并且其特異性單純地由sgRNA 決定，因此適用于高通量、全基因組的基因增強品系的構建(Ewen-Campen et al., 2017; Jia et al.,2018; 徐榮剛，王霞，王芳，孫錦，毛德才，喬歡歡，賈豫，朱芮葆，彭娉，劉魯萍，倪建泉, 2018)。

目前，哈佛醫學院TRiP 中心正在陸續構建覆蓋全基因組的基因突變和基因激活的sgRNA 品系，通過與阻止特異性Gal4 雜交，即可在后代果蠅中實現高效的基因突變或激活（https://fgr.hms.harvard.edu/trip-crispr-toolbox-fly-stocks）。不久的將來，研究人員將可以通過BDSC 果蠅中心輕松查詢和訂購所需sgRNA 轉基因果蠅品系，實現目的基因的敲除或激活。這些果蠅品系資源將與轉基因干擾品系結合使用，為果蠅研究提供重要的技術資源，使各個領域的研究達到事半功倍的效果。