大动物实验-动物试验中心-临床前研究「江苏美凤力医疗科技有限公司」

肺癌是全球癌癥死亡的首要原因，其中肺腺癌是肺癌最常見的類型之一。肺腺癌具有復(fù)雜的病理亞型分類，不同階段不同亞型的肺腺癌有著不同的預(yù)后。近年來，研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌的發(fā)病率相對較高，且具有多發(fā)性等特點，這對肺腺癌的診斷和治療有較大的挑戰(zhàn)性。因此，為了進一步探究肺腺癌的進展過程，我們需要一個更加貼合人類肺腺癌進展過程的臨床前模型來深入探討肺腺癌的發(fā)生機制。

目前腫瘤臨床前模型方法主要包括化學(xué)誘導(dǎo)、移植和基因編輯三大類別。其中基因編輯模型具有效率高，生存期長，在研究腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移及腫瘤微環(huán)境等方面發(fā)揮重要作用。通過CRISPR/Cas9等基因編輯工具，我們可以移除或植入某些特定的基因，從而激活動物形成腫瘤的模式。大鼠肉瘤（rat sarcoma，RAS）致癌基因是人類癌癥中最常突變的癌基因，Kirsten大鼠肉瘤（KRAS）是最常見的突變RAS亞型。人類肺癌31%～35%發(fā)現(xiàn)了KRAS癌基因的激活突變。KRAS突變在肺腺癌中更常見（20%～40%），在鱗狀NSCLC中較少見（約5%）。KRAS是一種與細(xì)胞膜相關(guān)的鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）信號蛋白，它調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和存活過程。超過80%的致癌 KRAS 突變發(fā)生在密碼子12,其中甘氨酸殘基被不同的氨基酸取代，導(dǎo)致 KRAS 突變腫瘤的基因組異質(zhì)性。在肺癌中，KRAS 癌基因替換通常發(fā)生在外顯子2的密碼子12和13處，常見的密碼子變體包含 G12C、G12D、G12V和G12A。

國際上應(yīng)用最廣泛的肺癌動物模型就是KRASLSL-G12D小鼠模型，通過與肺上皮細(xì)胞特異性的環(huán)化重組酶（Cyclization Recombination Enzyme，Cre）轉(zhuǎn)基因小鼠雜交或用慢病毒或腺病毒遞送Cre至肺組織內(nèi)來實現(xiàn)KRAS突變體的激活，從而導(dǎo)致肺癌的發(fā)生。KRASLSL-G12D中致癌KRAS突變的表達由一個可移動的轉(zhuǎn)錄終止元件Lox-Stop-Lox控制。在去除終止元件后，內(nèi)源性水平的致癌KRASG12D被表達。去除終止元件是通過Cre來實現(xiàn)，Cre是一種重組酶，來源于P1噬菌體，其基因編碼區(qū)序列全長1029 bp, 為38 kDa大小的、由343個氨基酸組成的多肽單體蛋白。Cre能識別特異的DNA序列，即loxP位點，使兩個loxP位點間發(fā)生基因重組。本實驗利用氣管插管遞送載有Cre重組酶的腺病毒（adenoviruses expressing Cre，Ad-Cre）感染KRASLSL-G12D條件突變小鼠肺組織細(xì)胞，通過切除位于KRASG12D轉(zhuǎn)基因上游的Lox-Stop-Lox, 進而使肺組織表達KRAS突變。

由于B6-KRASLSL-G12D純合子胚胎期即發(fā)生死亡，因此使用的KRAS條件突變小鼠均為雜合子，在繁衍過程需要不斷進行基因鑒定，出生后1～2周的小鼠收集少量腳趾或鼠尾組織，使用小鼠組織直接PCR試劑盒進行基因PCR鑒定，根據(jù)說明書配置PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：(1) 預(yù)變性94 ℃,5 min; (2) 35個循環(huán)反應(yīng)：變性94 ℃,10 sec ;退火60 ℃,20 sec; 延伸72 ℃,30 sec; (3) 終延伸72 ℃,5 min。反應(yīng)結(jié)束后各取4 μL,進行瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳（100 V, 30 min），電泳完畢進行核酸凝膠顯像。

在1～8個月每個時間段均成功造模20只小鼠，其中雌鼠和雄鼠各10只。通過小鼠肺HE染色，統(tǒng)計肺腺癌成瘤情況。結(jié)果顯示1個月的成瘤率為20%，2個月30%，3個月50%，4個月70%，5個月90%，6～8個月均為100%。通過各個感染時間的成瘤率繪制折線圖，可以看出隨著時間的延長，成瘤率越來越高，當(dāng)時間達到6個月時，所有的小鼠均發(fā)生了肺腺癌。

通過構(gòu)建肺腺癌模型，我們可以更好地模擬人類肺腺癌的發(fā)展過程，從而提高對肺腺癌病理學(xué)和分子生物學(xué)的理解。相較于化學(xué)誘導(dǎo)模型或移植瘤模型，基因編輯模型更貼近生物學(xué)真實情況，更準(zhǔn)確地反映了腫瘤的自然發(fā)展過程。我們的模型允許控制腫瘤發(fā)生的時間，且成瘤周期與自發(fā)性腫瘤類似?？捎糜谟^察不同階段的肺腺癌情況，為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供重要的研究工具。既往對小鼠肺腺癌原位移植瘤的研究顯示，原位移植瘤的成瘤時間基本在1個月內(nèi)。相對于原位移植瘤，基因編輯模型的成瘤時間相對較長，生存期也相對較長，這為藥物研發(fā)提供了更長的觀察期，為新藥的研發(fā)提供了更為充分的時間窗口。

Source: 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué).  2024, 32 (18)，KRAS條件突變小鼠肺腺癌模型的構(gòu)建